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世界许多国家和地区都有高致病性禽流感爆发,其不仅造成了养禽业的巨大经济损失,更因为存在禽流感病毒与人流感病毒重组的危险以及出现人际传播禽流感的可能性,因而如何有效防控禽流感倍受关注。禽流感病毒的非结构蛋白(non-structural protein,NS)——NS1蛋白,能抑制机体产生干扰素-α/β,利于禽流感病毒的进一步增殖,因此NS1基因是防控禽流感的重要靶基因之一。siRNA(small interfering RNA, siRNA)是能特异性沉默靶基因表达的双链RNA,但要实现siRNA在感染细胞中发挥作用,必须解决一系列技术难题,如siRNA必须能顺利到达细胞内且不会降解。应用噬菌体pRNA(packaging RNA)为导入载体,构建pRNA-siRNA纳米嵌合体为解决上述难题提供了可能。本研究拟筛选能沉默禽流感病毒NS1基因的siRNA,构建pRNA-siRNA,为深入研究NS1蛋白的功能、研发有效防控禽流感的全新核酸药物提供技术储备。为了构建pRNA-siRNA纳米嵌合体,根据siRNA设计原则,筛选出NS1基因编码区的siRNA作用靶序列;根据噬菌体pRNA序列,合成120个碱基的寡核苷酸作为模板;设计携带T7启动子和针对NS1基因的siRNA靶序列的引物,应用PCR技术,扩增出DNA,DNA产物命名为dpRNA-siRNA(t);应用T7 RNA聚合酶进行体外转录,获得携带针对NS1靶基因的pRNA-siRNA,命名为pRNA-siRNA(t)。构建pRNA-siRNA(c),其靶序列与鼠、人、犬、禽及禽流感病毒基因组序列无同源性,作为评估pRNA-siRNA沉默NS1基因效果的阴性对照。为了研究pRNA-siRNA纳米嵌合体对NS1基因的沉默效果,以pcDNA3.1(+)为骨架成功构建了表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pcEGFP和表达NS1-EGFP融合蛋白的质粒pcNS1-EGFP。转染细胞后,根据绿色荧光蛋白表达情况来判断NS1蛋白的表达水平。用针对NS1基因RNA第287～307靶位的pRNA-siRNA(287)与质粒pcNS1-EGFP共转染MDCK细胞,研究沉默效果,另同时分别以pRNA-siRN(A287)和质粒pcEGFP共转染MDCK细胞以及pRNA-siRNA(c)和质粒pcNS1-EGFP共转染MDCK细胞作为阴性对照。结果显示pRNA-siRNA(287)在MDCK细胞上具有一定的特异性沉默NS1基因的功能。