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目的：辣椒素受体(vanilloid receptor type1,VR1)于1997年被克隆,是一种非选择性阳离子通道蛋白质,主要分布于伤害性感觉神经元。它可被化学,机械和热刺激如温度(>43℃)、酸(pH<6,0)等激活,使阳离子(主要是Ca2+)从胞外进入胞内,从而产生痛觉。虽然已有少量文献报道在各种神经痛疼痛模型中,辣椒素受体的表达都会发生变化,但是对于辣椒素受体在神经痛疼痛发生机制中的作用仍然不是很清楚。本实验拟应用RNA干扰技术,以脊神经结扎(SNL)神经痛模型大鼠为实验动物,揭示辣椒素受体在神经痛疼痛发生机制中的作用。
方法：本实验首先构建靶向大鼠辣椒素受体的siRNA慢病毒载体(pRNAT-U6.2/Lenti-siVR1),并用蛛网膜下腔注射的方式将其注射到正常大鼠体内,鉴定其是否可以在整体水平沉默VR1的表达。另一方面,制作脊神经结扎(SNL)神经痛大鼠模型,观察疼痛行为的经时变化过程,找出疼痛最敏感最稳定的时期进行后续研究。此后制作SNL大鼠模型并分三组,分别是阳性组(注射pRNAT-U6.2/Lenti-siVR1)、阴性组(注射无关序列)及模型组(不做任何处理)。在SNL手术后第5天将所合成的DRNAT-U6.2/Lenti-siVR1注射到大鼠蛛网膜下腔,特异性地使SNL大鼠辣椒素受体的mRNA降解,从而使该基因的表达沉寂。从行为学上观察神经痛大鼠的疼痛行为是否会有所改善,同时应用RT-PCR技术半定量检测辣椒素受体的mRNA是否会下降,应用Western Blot技术检测辣椒素受体蛋白的表达是否会下降。
结果：本实验成功构建靶向辣椒素受体的siRNA慢病毒载体(pRNAT-U6.2/Lenti-siVR1),经动物整体实验证实其可以沉默VR1mRNA的表达。蛛网膜下腔注射pRNAT-U6.2/Lenti-siVR16小时后,阳性组和阴性组大鼠的缩足阈(PWT)没有显著差异性,即此时SD大鼠仍然处于痛觉过敏时期。但12、24小时后,阳性组大鼠的PWT明显升高,分别为9.7g±2.4g、10.9±2.8g,而阴性组大鼠的PWT分别为3.8g±0.7g、3.9g±0.8g,阳性组与阴性组比较有显著差异(P<0.05)。蛛网膜下腔注射siVR148小时后,阳性组和阴性组大鼠的PWT差异性消失(P>0.05),其PWT分别为5.2±1.3g、4.9±1.8g。在RT-PCR试验中,可以观察到注射12小时后,阳性组大鼠与阴性组大鼠相比,其脊髓背角和DRG神经元内辣椒素受体的mRNA均显著降低,脊髓背角VR1mRNA降低了约48.7％,而DRG mRNA约为51.4％；而阴性组与正常组及模型组相比较,无论是脊髓背角还是DRG神经元其mRNA并没有显著性差异。Western Blot实验也证实了辣椒素受体蛋白的表达也会降低,脊髓背角VR1蛋白降低了约44.3％,而DRG mRNA约为62.4％；而阴性组与正常组及模型组相比较,无论是脊髓背角还是DRG神经元其蛋白表达都没有显著性差异。
结论：本实验所构建的靶向大鼠辣椒素受体的siRNA慢病毒载体(pRNAT-U6.2/Lenti-siVRl)经蛛网膜下腔注射后,在大鼠整体水平具有很好的靶基因沉默效应,并且能够显著提高SNL神经痛大鼠的缩足阈。说明采用RNA干扰技术可以降低SNL大鼠辣椒素受体的表达,辣椒素受体参与了大鼠神经痛的发生过程。