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本论文利用RNAi技术进行了抗HBV的研究.利用RNA聚合酶Ⅲ启动子U6构建了shRNA表达载体pU6P:在HBV基因组上选择了包含所有编码框在内的12个干扰靶点,构建针对HBV的shRNA表达载体pU6-siHBV;pU6-siHBV转染2.2.15细胞,通过测定培养液内HBV抗原含量,发现12个质粒中的5个对HBsAg的表达有明显的抑制作用,最高达72.8±5.4﹪;对HBeAg的抑制率最高为55.8±6.2﹪.定量PCR结果显示,质粒转染后培养液中HBV DNA的含量下降了1.9倍.细胞同时转染阴性对照质粒pU6-siGFP,对HBV蛋白表达和病毒复制没有影响,说明RNAi作用具有序列特异性.利用瞬时转染筛选得到的有效靶点构建含有puromycin筛选标记的shRNA表达载体pGK-siHBV,转染2.2.15细胞后,经puromycin筛选得到稳定抑制HBV蛋白表达的细胞株,用PCR和测序证实其基因组确实整合了转染质粒的序列.对稳定株的鉴定实验表明,与2.2.15细胞相比,稳定株对培养上清中HBsAg的抑制率达95﹪左右,对HBeAg的抑制率在80﹪以上;而细胞免疫化学结果显示,在稳定株细胞中几乎找不到HBsAg或HBcAg阳性细胞.说明shRNA的持续表达对HBV蛋白表达的抑制非常明显,Northern Blot和Western Blot的结果也支持这一观点.稳定转染细胞株比2.2.15细胞HBV DNA含量降低10倍.经空载体pU6P稳定转染的细胞株对HBV的蛋白表达和复制没有影响,说明抑制效果确实是由RNAi作用引起的.为验证在动物水平RNAi的抗病毒作用,将pU6-siHBV质粒用hydrodynamics的方法经尾静脉注射到HBV转基因小鼠体内,注射后小鼠血清转氨酶有一过性升高,但很快恢复正常,肝脏切片没有明显的病理性改变,说明这种注射方法是安全的.质粒注射后5天,血清HBsAg下降了56.7﹪,抑制作用至少持续2周.肝脏免疫组织化学结果显示HBcAg阳性细胞明显减少,说明RNAi能有效抑制转基因小鼠体内HBV的蛋白质表达.但HBV DNA定量没有明显的降低.除上述质粒介导的实验外,还用化学合成的siRNA进行了细胞实验.结果显示siRNA最佳的作用浓度是100nM,转染后3天抑制率最高.蛋白质和mRNA水平的检测都证实siRNA能有效并且特异地抑制HBV蛋白质的表达.总之,本论文从细胞到动物实验的结果证明RNAi能有效抑制HBV的蛋白表达和病毒复制,为其用于乙型肝炎的治疗提供了实验依据.尤其是稳定细胞株的建立,不仅实现了对HBV蛋白表达和病毒复制的稳定抑制,而且为RNAi抗HBV的机制研究搭建了一个良好的平台.