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目的:缺血性脑血管疾病是严重危害人类健康的常见病和多发病,其发病率和死亡率在国内外均居前位。目前对其发病机制及治疗措施的研究一直是人们关注的热点。乙酰化左旋肉碱由左旋肉碱经肉毒碱乙酰转移酶催化生成,可作为乙酰胆碱和L-谷氨酸的来源,促进细胞能量合成。文献报道,乙酰化左旋肉碱具有显著的神经保护作用,可用于缺血性脑损伤和神经退行性疾病的治疗,但其确切机制尚不清楚。本文主要观察乙酰化左旋肉碱(ALC)对大鼠缺血性脑损伤的保护作用,并探讨其可能的机制。
方法:
1：观察ALC对局灶性大鼠脑缺血的保护作用:采用改良的线栓大鼠大脑中动脉的方法制作大鼠缺血模型,计算脑梗死体积百分比,观察ALC对此模型的脑缺血保护作用。
2：细胞培养:PC12细胞培养于含DMEM完全培养基的培养瓶,置于37℃,5％CO2,95％空气饱和湿度的CO2培养箱内培养。
3：PC12细胞缺血缺氧损伤模型的建立与实验分组:PC12细胞以1.0×108L-1的密度接种,培养24 h后加入含糖0.5 mg/mL、含Na2S2O43mmol·L-1的DMEM溶液继续培养3 h。实验分为3组:正常组、模型组(缺血缺氧组)即:用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)合并低糖培养基建立体外细胞缺血缺氧损伤模型、ALC组(ALC预处理24 h后,用Na2S2O4合并低糖培养基继续培养3 h)。
4：MTT法检测ALC预作用24 h后细胞活力的改变:96孔板中的各组细胞每孔加入MTT(5 mg/mL)100μL,37℃孵育4 h,每孔各加DMSO200μL,然后在酶标仪上于570 nm波长处测吸光度(OD值)。
5：TUNEL染色法:缺血缺氧损伤的PC12细胞凋亡细胞百分比用凋亡细胞数占总细胞数比值求得。
6：用酶化学法测定ALC预作用24 h后低糖低氧诱导的PC12细胞丙二醛(MDA)的变化:观察ALC对缺血缺氧损伤的PC12细胞的保护作用。
7：超氧化物歧化酶SOD活性检测:按试剂盒说明书要求测定各组细胞SOD活力。
结果:
1：ALC能明显降低局灶性脑缺血大鼠的脑梗死体积百分比。
脑组织切片染色结果表明,大鼠大脑中动脉缺血模型后6 h,模型组的大鼠患侧半球大脑中动脉供血区软化、苍白。ALC组的患侧半球软化、苍白区缩小。线栓法致大鼠局灶性脑缺血模型组脑组织脑梗死体积百分比明显高于假手术组(O),ALC组脑梗死体积百分比为14.02％±2.03％,与模型组23.53％±2.56％比较,差异有明显统计学意义(P＜0.01,n=6),表明ALC能明显降低缺血大鼠的脑梗死体积百分比。
2：低糖可导致细胞损伤,程度随糖浓度降低而加重。
与正常组细胞相比,合并Na2S2O4基质低糖的模型组细胞发生低糖、低氧。模型组细胞活力下降,细胞存活率降低,表现为吸光度明显下降。
3：ALC对缺血缺氧所致的PC12细胞损伤具有保护作用。
MTT结果显示,不同浓度ALC对正常组和模型组细胞活性的影响不同。低于800μmol·L-1的ALC对正常PC12细胞的活性无明显影响,800μmol·L-1～20 mmol·L-1的ALC降低正常组细胞活性,表现为OD值下降。而100～600μmol·L-1 ALC预作用24 h后可以不同程度提高模型组细胞细胞活力。
4：ALC抑制缺血缺氧所致的细胞凋亡。
TUNEL染色结果表明,模型组凋亡细胞数明显高于正常组,ALC预作用24 h后凋亡细胞数明显下降。模型组凋亡细胞所占正常细胞的百分率为10.22％±2.84％,与正常组0.91％±0.28％相比,具有明显统计学意义(P＜0.01,n=4)。200μmol·L-1的ALC预作用24 h后能明显减少凋亡细胞百分率至0.95％±0.57％(P＜0.01,n=4)。
5：ALC降低缺血缺氧损伤PC12细胞的MDA含量。
缺血缺氧损伤的PC12细胞匀浆MDA活性为1.04±0.20 nmol/mgprotein,与对照组0.49±0.10 nmol/mg protein相比明显升高(P＜0.05,n=6)。200μmol·L-1的ALC可明显降低细胞匀浆中升高的MDA含量(0.16±0.03 nmol/mg protein),与模型组相比具有明显统计学意义(P＜0.01,n=6)。
6：ALC增强缺血缺氧损伤PC12细胞的SOD活性。
模型组细胞SOD活性为7.17±1.14 U/mg protein,与正常组10.13±0.03 U/mg protein相比明显下降(P＜0.05,n=6)。200μmol·L-1的ALC可明显升高缺血缺氧损伤PC12细胞的SOD活性(17.26±2.84 U/mgprotein),与模型组相比具有明显统计学意义(P＜0.01,n=6),表明ALC可增强缺血缺氧损伤PC12细胞的SOD活性。
结论:
ALC能明显减轻大鼠大脑中动脉缺血模型脑损伤,对缺血缺氧所致的PC12细胞损伤也具有保护作用,其机制可能与增强细胞抗氧化能力、减少自由基生成、抑制脂质过氧化反应及抑制细胞凋亡有关。