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研究背景:吡咯里西啶生物碱(pyrrolizidine alkaloids,PAs)是植物体内的一种有毒次生防御化合物,超过6000种植物体内发现了超过660种的PAs及吡咯里西啶生物碱氮氧化物。研究表明,不饱和PAs具有严重的肝毒性,其经细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)3A代谢后形成吡咯代谢物,该代谢物具有很强的亲电子性,可与胞内多种重要的亲核物质(如蛋白质、DNA)形成加合物,导致细胞的凋亡或死亡,引起肝细胞出血性坏死、肝巨红细胞症及静脉闭塞症等。文献和本室前期研究证实,孕期PAs暴露可以引起发育毒性。大鼠孕中晚期暴露于大剂量野百合碱(monocrotaline,MCT),胎仔可出现发育迟缓。但PAs的发育毒性作用的代谢损伤机制目前尚未证实。目的:本研究旨在以倒千里光碱(retrorsine,RTS)和MCT为PAs的代表药物,研究PAs在母胎的代谢特征,观察孕期PAs暴露对大鼠胎盘和胎肝的损伤作用,并比较母胎肝对PAs代谢活化的差异,以期探讨PAs的发育毒性及其代谢损伤机制。方法:部分Wistar受孕大鼠在孕20天(gestation day,GD20)剖腹取胎,收集母肝、胎肝和胎盘,经不同速度离心得到微粒体备用;同时收集两周龄新生鼠肝脏,Realtime-PCR技术检测母肝、胎肝及新生鼠(两周龄)肝脏各CYP3A亚型的mRNA表达。另一部分Wistar孕鼠随机分为五个组,即对照组、RTS5组、RTS10组、RTS20组和MCT20组,每组10-12只。自GD9至GD20,给药组每日分别灌胃给予5、10、20 mg/kg的RTS及20 mg/kg MCT,对照组给予等容量的溶媒,记录孕鼠每天的体重变化,计算孕鼠体重增长率。并于GD20天时乙醚麻醉孕鼠后剖腹取胎,记录胎肝和胎盘重量,收集母肝、胎肝、胎盘及血清。苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察母肝、胎肝及胎盘组织形态学改变。Western blot检测正常母、胎肝、RTS20和MCT20组胎肝中CYP3A的表达,LC-MS/MS检测血清中原型RTS和MCT的含量、肝脏及胎盘中吡咯蛋白结合物(pyrrole protein adducts,PPAs)的含量,检测正常母肝、胎肝、新生鼠肝脏及胎盘微粒体对RTS及MCT的代谢活性,以及母、胎肝对RTS和MCT的酶促动力学检测。通过转染Sf9细胞获得重组CYP3A4及CYP3A7的蛋白并检测两者对RTS的代谢活性。结果:①正常母、胎肝及胎盘CYP3A表达及其微粒体对PAs的代谢活性情况:正常情况下CYP3A的含量及微粒体对PAs的代谢活性为母肝>胎盘>胎肝,且雄性胎肝CYP3A的表达及其微粒体对PAs活性均高于雌性(P<0.05);酶促动力学分析结果发现母肝微粒体对于RTS及MCT的活性均高于胎肝,母肝微粒体对RTS和MCT的CLint分别是雌性肝脏的21.9和8.6倍,是雄性肝脏微粒体10.8和5.2倍。②母、胎鼠一般情况:暴露于10、20 mg/kg的RTS及20 mg/kg MCT孕鼠的体重增长率低于对照组,且GD20时的体重也低于对照组;暴露于20 mg/kg的RTS及20 mg/kg MCT的胎鼠体重、胎肝重量及胎盘重量均显著低于对照组(P<0.01)。③母、胎肝及胎盘形态学:HE结果显示,暴露于不同剂量RTS或20 mg/kg MCT时母、胎肝及胎盘均有不同程度的组织损伤,相较于母肝,胎肝损伤较重,暴露于20 mg/kg RTS或MCT的胎肝空泡样间质细胞增多而肝细胞减少,雌性病理改变更为明显,10 mg/kg RTS组雌性胎肝即可见空泡样改变;胎盘暴露于20 mg/kg RTS和MCT时蜕膜区变薄,组织形态紊乱,部分出现纤维化,基底区部分糖原细胞坏死脱落形成囊腔,迷路区结构紊乱,滋养层细胞体积变小,核萎缩,且出现明显的充血现象。④母、胎血中原型PAs以及母、胎肝中PPAs的含量:检测发现母、胎血中两种原型PAs的含量几乎处于同一水平,且雌性和雄性胎血间无显著差异;组织中PPAs的含量为母肝>胎盘>胎肝;并且暴露于20 mg/kg的RTS及MCT的雌性胎肝中PPAs的含量高于雄性(P<0.05),且以MCT组差异更为显著(P<0.01)。⑤PAs对胎鼠肝脏CYP3A表达的影响:检测发现,孕期暴露于20 mg/kg的RTS或MCT时,两种PAs均可诱导雌性肝脏中CYP3A表达增高(P<0.01),且抑制雄性CYP3A表达(P<0.05)。⑥母胎肝及新生鼠肝脏中CYP3A亚型的mRNA表达及其微粒体对RTS和MCT的代谢活性:检测发现,母胎肝及新生鼠肝脏中主要CYP3A亚型表达不同,母肝中主要表达CYP3A1/23及CYP3A9 mRNA,这两种亚型则在胎肝中表达较低甚至无表达(P<0.01),新生儿胎肝中主要表达CYP3A1/23、3A2、3A18以及3A62,其中CYP3A2表达远高于母肝(P<0.01);活性检测发现,新生鼠肝微粒体对RTS的代谢活性明显高于母肝及胎肝(P<0.01);⑦CYP3A4与CYP3A7对RTS的代谢活性检测:CYP3A7对RTS的代谢活性高于CYP3A4。结论:1)胎肝及胎盘均有CYP3A蛋白表达,且具有代谢活性,其中雄性代谢活性高于雌性;2)孕中晚期暴露于PAs可直接通过胎盘屏障进入胎儿体内,并导致胎儿低出生体重及明显的组织损伤,且胎组织对PAs毒性更加敏感;3)孕中晚期PAs暴露诱导雌性胎肝及胎盘中CYP3A蛋白表达增加,可能是雌性损伤更明显的原因之一;4)CYP3A亚型在母亲和子代表达和活性的不同可能是造成PAs母胎毒性差异的主要原因。