论文部分内容阅读
目前,很多研究表明转基因克隆动物中DNA甲基化表现为多相的。但是,很少有研究证明转基因体细胞克隆绵羊中的DNA甲基化水平,可能主要是由于缺少转基因体细胞克隆绵羊的材料,或者绵羊基因组中的印记基因的信息。为了研究转基因体细胞克隆绵羊重编程的程度,本研究中以印记基因H19, IGF2, IGF2R, DLK1和Gtl2为研究对象,研究其CpG岛或者差异甲基化区域(differentially methylated regions,DMR)在转基因体细胞克隆绵羊不同组织(心脏、肺脏、肌肉)DNA甲基化程度。首先,制作石蜡切片、HE染色观察心脏、肺脏、肌肉的形态；然后利用生物信息学软件或者在线数据库分析以上5个印记基因,包括基因结构、CpG岛预测、蛋白质结构预测、构建分子进化树；接着,利用MassArray平台检测了5个印记基因在3种不同组织的甲基化水平；最后,根据获得的甲基化数据,进行了深度数据挖掘分析。通过以上实验,得到的结果如下：1.转基因体细胞克隆绵羊死产绵羊心脏、肺脏、肌肉3种组织经病理组织形态学观察没有明显异常,总体器官形态正常。2.五个印记基因中11个CpG岛,包括基因上游序列、外显子、内含子、可变剪切位点区域,被用来研究印记基因的DNA甲基化情况。3.H19基因的CpG岛在死亡转基因体细胞克隆绵羊和对照组绵羊组织之间的DNA甲基化无显著性差异,但是存在特异CpG位点甲基化。4. IGF2基因的CpG岛的甲基化在两组试验中无显著性差异,但是我们发现在死亡转基因体细胞克隆绵羊中的甲基化水平略高于对照组。而且,IGF2的第一个候选区域在死亡转基因体细胞克隆绵羊中表现为组织差异性甲基化。5. IGF2R基因的CpG岛的甲基化在死亡转基因克隆绵羊和对照组中都表现为组内甲基化组织差异性,但是两组之间无显著性差异。6.DLK1基因的第一个候选区域在死亡转基因体细胞克隆绵羊和对照组之间甲基化无显著性差异,并且都表现为超低甲基化水平。但是,在第二个候选区域中,46个CpG位点的甲基化在两组试验动物之间均表现为显著性差异。7.GTL2基因的三个候选区域在死亡转基因克隆绵羊和对照组之间无显著性差异,但是,在剪切位点区域的CpG位点表现为高甲基化水平总之,我们获得了一定的数据表明在死亡转基因克隆绵羊和对照组中存在个别印记基因的DNA甲基化差异。但是不足以作为充分的证据去证明转基因克隆绵羊在重编程过程中出现了异常,还需要更多的证据,比如增加印记基因的研究数量、增加更多的研究材料(包括动物个体、组织)、探讨印记基因的mRNA在不同发育期的表达、检测印记基因在不同发育期的DNA甲基化情况等等。