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研究背景随着社会经济的发展,人口的老龄化和人们生活水平的提高,糖尿病(Diabetes mellitus, DM)的患病率逐年攀升,严重威胁着人们的身心健康。糖尿病大血管病变,如动脉粥样硬化、血栓性大血管病变所致的冠心病、脑血管及周围血管疾病是糖尿病患者高死亡率和致残的主要原因之一。长期高血糖是导致血管内皮功能障碍的主要危险因素。而内皮功能障碍是糖尿病血管病变的始动因素和早期表现,在糖尿病血管病变的发生发展中起着重要作用。因此,防治高糖导致的内皮细胞损伤、保护血管内皮功能,对防治糖尿病心血管并发症有重要意义。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是肿瘤坏死因子家族的新成员,在细胞凋亡、炎症反应和免疫应答过程中有重要的调控作用。TRAIL可与肿瘤坏死因子家族的五种高亲和力受体结合。TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)作为死亡受体,与TRAIL结合后能够诱导凋亡信号途径的激活,导致细胞凋亡；而TPRAIL-R3(DcRl)、TRAIL-R4(DcR2)和OPG (osteoprotegerin)缺少功能性死亡域和诱导细胞凋亡的能力,作为诱导性受体,可与TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)竞争性的与TRAIL结合,具有抑制正常细胞凋亡的作用。近年来,有实验数据表明,TRAIL在糖尿病及心血管疾病中起着重要的作用。体内和体外研究数据均证明TRAIL有潜在的心血管保护作用。体外研究显示,在缺乏培养基的条件下,重组TRAIL可通过激活Akt和ERK通路促进人脐静脉内皮细胞的生存和增殖。同时,有体内研究表明,在使用重组TRAIL干预ApoE-／-鼠的糖尿病模型时,可观察到TRAIL通过增加血管平滑肌细胞的含量以稳定动脉粥样硬化斑块,并降低斑块的整体面积；并且有研究表明,TRAIL-/-联合Apoe-/-敲除鼠的动脉粥样硬化发生率及程度明显高于Apoe-／-敲除鼠。最近三项体内研究已经表明,TRAIL的血清水平在糖尿病和动脉粥样硬化患者显着降低,并且TRAIL水平降低程度与内皮功能呈正相关。然而,迄今为止,TRAIL干预是否对高糖导致血管内皮功能障碍有保护作用尚不清楚。因此,我们假设TRAIL可保护高糖导致的血管内皮损伤。本研究主要从体内和体外两部分实验来评估TRAIL对血管内皮的作用。研究目的本研究旨在明确：1.研究TRAIL对糖尿病大鼠血管内皮功能障碍是否有保护作用；2.研究TRAIL对体外高糖环境导致的氧化应激及内皮细胞凋亡的作用；3.探讨体外高糖环境下TRAIL对内皮细胞作用的可能信号转导机制。方法一、动物实验1.4周龄雄性SD大鼠30只,随机留取10只作为正常对照(NC)组,以普通饲料喂养,其余20只用于建立2型糖尿病模型,以高脂饲料喂养。6周后所有大鼠禁食禁水12h,给予高脂组STZ35mg/Kg(用前以0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制成1%STZ溶液)一次性腹腔注射,普通饲料组则给予等容量的柠檬酸盐缓冲液一次性腹腔注射。诊断标准为空腹血糖(FPG)≥16.7mmol/L。将造模成功大鼠随机分为对照(DM)组(10只)和TRAIL干预组(10只),同时TRAIL干预组予重组TRAIL(20ug/只)腹腔注射,每周1次,连续6周。NC与DM组予等量的蒸馏水腹腔注射,连续6周。2.实验结束时,腹腔注射1%戊巴比妥钠50mg·kg-1麻醉大鼠,迅速开胸,腹主动脉采血后,迅速分离并取出胸主动脉,观察大鼠离体主动脉对乙酚胆碱(Ahc)依赖性血管舒张反应。ELISA试剂盒检测血浆TRAIL浓度；Griess重氮化反应法检测主动脉NO含量；免疫组化SP法检测主动脉eNOS的活性；Western blot检测主动脉eNOS和P-eNOS的表达水平。二、细胞实验1.细胞培养：使用胶原酶灌注新鲜的脐带提取原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。HUVECs培养在明胶包被的组织培养板中,并在M199内皮细胞生长培养基中添加20%FBS,10ug/m1肝素和50ug/mlECGF(血管内皮细胞生长因子)。所有实验,使用第2-4代细胞。2.细胞分组：实验分为5组；(1)正糖对照组(葡萄糖终浓度为5.5mmol/L,NG)；(2)高糖组(葡萄糖终浓度33mmol/L,HG)；(3)HG+TRAIL组(100ng/ml TRAILy预先培养18h,再加入终浓度33mmo1/L的葡萄糖)；(4)HG+TRAIL+LY组(内皮细胞先经含10μmol/L的3一磷脂酰肌醇激酶(PI3K)阻断剂LY294002的培养基预处理30min,余处理同HG+TRAIL组)；(5)HG+TRAIL+L-NAME组(内皮细胞先经含10Oμmol/L的eNOS的阻断剂L-NAME的培养基预处理30min,余处理同HG+TRAIL组)。3.Annexin-V-FITC/PI双染法和TUNEL法检测细胞凋亡；以DCFH-DA为探针检测细胞的ROS；实时定量RT-PCR检测细胞的SOD,GPx-1的表达；Westernblot分析主动脉Akt,P-Akt,eNOS,P-eNOS的表达。统计分析采用SPSS13.0进行统计学处理。实验数据以x±s表示。两组之间比较使用独立样本t检验。多组间比较使用One-Way ANOVA(单因素方差分析)方法,两组间比较用最小显著差(LSD)t检验,以P<0.05为显著性指标。结果一、动物实验结果1.糖尿病组大鼠血浆TRAIL浓度显著低于正常组(56.6±5.5vs.36.5±3.1,P<0.001)2.TRAIL对糖尿病大鼠主动脉内皮依赖性血管舒张功能的影响与对常对照组比较,糖尿病组大鼠胸主动脉内皮依赖性血管舒张功能明显降低[(63.5±4.6)%vs.(93.5±2.6)%,P<0.001]。与糖尿病组比较,TRAIL干预组血管舒张功能明显改善,[(63.5±4.6)%vs.(78.44±2.7)%(P<0.001)]。而NaN02诱导的内皮非依赖性血管舒张反应在三组大鼠中无明显差异。TRAIL干预糖尿病大鼠能明显减轻ACh诱导的内皮依赖性舒张功能损伤而对内皮非依赖性血管舒张功能无明显影响。这些结果显示TRAIL干预明显改善了糖尿病引起的内皮依赖性舒张功能障碍。3.各组大鼠主动脉NO含量和eNOS免疫组化的结果与NC组比较,TRAIL、DM组大鼠主动脉NO浓度、eNOS免疫组化阳性表达显著降低(P<0.001);与糖尿病对照组比较,TRAIL组主动脉NO浓度,主动脉内皮eNOS阳性表达显著升高(p<0.001)。4.TRAIL对大鼠胸主动脉组织中eNOS蛋白表达的影响与正常对照组比较,P-eNOS蛋白水平在糖尿病组明显降低(P＜0.01)。 TRAIL干预6周显著提高糖尿病大鼠胸主动脉组织P-eNOS蛋白表达水平(P<0.01)。二、细胞实验结果1.TUNEL染色：高糖组干预细胞48h后,细胞凋亡率较正糖对照组明显上升(5.9±0.8%vs.37.4±0.9%,p<0.001),而高糖+TRAIL组的细胞凋亡率较高糖对照组降低(17.2±0.4%vs.37.4±0.9%,p<0.001)。HG+TRAIL+LY组与HG+TRAIL+L-NAME组细胞凋亡率较正糖对照组明显升高,而与高糖对照组无明显差异(p<0.001),表明TRAIL抑制细胞的凋亡作用被LY294002和L-NAME阻断。2. AnnexinVFITC/PI:与正糖对照组相比,高糖对照组内皮细胞调亡率明显增加(p<0.01),高糖+TRAIL组的细胞凋亡率较高糖对照组降低。而HG+TRAIL+LY组与HG+TRAIL+L-NAME组细胞凋亡率较正糖对照组明显升高,而与高糖对照组无明显差异(p<0.01)。3.TRAIL对细胞内ROS生成的影响：正常对照组内皮细胞内荧光强度较弱,ROS产生较低；高糖作用于内皮细胞48h后,内皮细胞内荧光强度很强,ROS产生明显多于对照组。TRAIL干预组内皮细胞ROS的生成明显降低；TRAIL+高糖+LY组及TRAIL+高糖+L-NAME组细胞内荧光强度明显高于TRAIL+高糖组,ROS生成增多。4.实时定量PCR检测细胞内SOD、GPx-1的表达：与正糖对照组相比,高糖对照组SOD、GPx-1表达明显减低(p<0.001),高糖+TRAIL组的SOD、GPx-1较高糖对照组升高。而HG+TRAIL+LY组与HG+TRAIL+L-NAME组SOD、GPx-1表达较正糖对照组明显降低,而与高糖对照组无明显差异(p<0.001)。5.TRAIL对细胞内Akt, P-Akt, eNOS, P-eNOS蛋白表达的影响：与正糖对照组相比,高糖对照组P-Akt, P-eNOS表达明显减低(p<0.001),高糖+TRAIL组的P-Akt,P-eNOS较高糖对照组升高。而HG+TRAIL+LY组与HG+TRAIL+L-NAME组SOD、GPx-1表达较正糖对照组明显减低,而与高糖对照组无明显差异(p<0.001)。TRAIL对细胞内Akt,eNOS的表达无明显影响。结论1.TRAIL干预可明显改善糖尿病大鼠的主动脉内皮依赖性舒张功能,提示TRAIL对内皮功能有一定的保护作用。由于TRAIL可促P-eNOS的表达和NO的生成,并提示TRAIL保护内皮功能的作用可能是通过促进eNOS的表达和NO的生成而达到的。2.TRAIL能对抗体外高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡,抑制ROS的生成,促进SOD、GPx-1mRNA的表达,并且上调P-Akt,P-eNOS的表达,并且TRAIL的这种保护作用可以被PI3K阻断剂LY294002和eNOS的阻断剂L-NAME消除。从而进一步证明TRAIL对体外高糖诱导内皮细胞损伤的保护足有可能是通过PI3K/Akt/eNOS途径介导的。