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研究背景抗SSA/Ro 60kDa抗体见于多种自身免疫病患者,生理状态下与SSA/Ro52核蛋白及hYRNA共同构成核糖核蛋白复合体SSA/Ro抗原。系统性红斑狼疮(SLE)患者血清抗Ro抗体阳性率高达50%,而干燥综合征(SS)患者血清阳性率在50%以上。最初人们使用双扩散法在抗核抗体(ANA)阴性的SLE患者血清中发现该抗体。此后在SS的患者血清中证实为SSA。抗SSA/Ro 60kDa抗体除了和某些临床表现相关,还和HLA表型和T细胞受体基因有关。出现Ro沉淀线的血清都有抗60kDa的抗体存在,与SSA/Ro 60kDa抗原结合的hYRNA有四种,结构短并且富含尿嘧啶。在部分抗SSA/Ro 60kDa抗体阳性的血清中往往出现抗SSA/Ro 52kDa抗体。SSA/Ro 60kDa-hYRNA和SSA/Ro 52kDa的关系尚有争议。Scofield等研究SSA/Ro 60kDa蛋白7个氨基酸残基的寡肽,发现了20个明确的抗原表位,并且发现患者血清和这些表位的结合情况有较大差异。使用合成的60-kDa Ro表位多肽免疫BALB/c鼠,出现针对整个抗原颗粒的抗体,这和人类的SLE或SS相似。而且免疫后的小鼠唾液流率较对照组下降,唾液腺出现炎细胞浸润。本课题首先成功构建了抗Ro抗体单链可变区(Single-chain Fv,ScFv)噬菌体抗体库,根据课题组初步临床研究的结果,人工合成SSA/Ro60kDa抗原3个表位多肽(P1表位:482～493,P2表位:310～323,P3表位:230～241),用3个多肽从ScFv噬菌体抗体库中筛选获得3个ScFv单抗。通过这三个表位特异性抗体研究SLE动物模型肾脏SSA/Ro 60kDa抗原表位的表达,解释SLE发病的相关机制。研究目的1、验证利用噬菌体展示技术表达抗SSA/Ro 60kDa抗原表位特异性抗体。获取3个抗SSA/Ro 60kDa抗原的表位特异性抗体,使用镍柱进行纯化。2、利用获得的抗SSA/Ro 60kDa表位特异性抗体研究MRL/lpr和BALB/c鼠肾脏SSA/Ro 60kDa不同表位的表达。方法1、对接收克隆进行序列分析,提取质粒,制作感受态细胞。将质粒转化于大肠杆菌ORIGAMI,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。SDS-PAGE胶电泳分析表达是否成功。Western-blot检测目的蛋白中是否带有6×His标签,使用镍柱进行蛋白纯化。2以小鼠SSA/Ro 60kDa抗原为底物,ELISA法检测抗体活性。用Hep-2细胞为底物,间接免疫荧光等方法检测抗体活性。3、对MRL/lpr和BALB/c两种鼠模型,通过免疫组化法分析肾脏、脾脏、肝脏等SSA/Ro 60kDa抗原不同表位表达的情况。利用专业图像软件分析SSA/Ro 60kDa抗原表位和器官损伤之间的关系。结果1、对接收克隆的插入基因进行序列分析,提示插入基因序列与此前提供的测序结果完全符合,插入基因未发生突变。pET32a(+)质粒成功转入表达菌ORIGAMI。经IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE胶电泳发现相应分子量的目的蛋白大量表达。Western-blot提示目的蛋白均带有6×his标签。经Ni柱纯化蛋白,获得相应的单链抗体。2、以小鼠SSA/Ro 60kDa抗原为底物,ELISA法检测抗体活性,结果显示三种单抗反应均为阳性。以Hep-2细胞为底物,间接免疫荧光法检测抗体的在体活性,结果显示,三种抗体均和Hep-2细胞结合,胞浆及胞核均有荧光染色,符合抗SSA抗体间接免疫荧光法检测的荧光特点。3、MRL/lpr小鼠模拟人自身免疫性疾病系统性红斑狼疮和继发性干燥综合征。HE染色提示20周龄MRL/lpr小鼠肾脏出现大量炎细胞聚集,类似狼疮肾炎的病理改变。同周龄的BALB/c小鼠肾脏未出现病理改变。4、MRL/lpr组和BALB/c组肾小球、近端肾小管、远端肾小管、集合管胞浆及胞核均可见棕黄色颗粒。Image-pro plus软件分析结果显示,MRL/lpr组和BALB/c鼠P1、P2、P3阳性表达的积分光密度(IOD)值差异无统计学意义。MRL/lpr组及BALB/c组内P1、P2、P3的IOD值,差异无统计学意义。5、统计细胞核阳性率,MRL/lpr组P3细胞核阳性率高于BALB/c组,差异有统计学意义(p＜0.05)。6、MRL/lpr组内P1、P2、P3细胞核阳性率差异有统计学意义(F=4.74,p＜0.05)。MRL/lpr组内两两比较发现P3表达高于P1、P2表位,差异有统计学意义(p＜0.05)。BALB/c组内P、P2、P3细胞核阳性率差异无统计学意义。7、MRL/lpr小鼠脾脏增大,肝脏、心脏等实质性脏器未见明显淋巴细胞浸润。两组小鼠脾脏P1、P2、P3表位表达均为阴性;两组小鼠肝脏组织P1、P2、P3染色均为胞浆弥漫淡棕色,胞核无着色。结论1、利用噬菌体展示技术可以成功表达抗SSA/Ro 60kDa抗原表位特异性抗体。2、获得的SSA/Ro 60kDa表位特异性单链抗体具备良好的抗原结合能力,可以用于动物模型研究。3、自身免疫状态下SSA/Ro 60kDa表位的核表达上调。SSA/Ro 60kDa aa230～241表位可能参与炎症反应。