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目的:
1.对芒果叶(Mangiferaindica L.)及其混伪品扁桃叶(MangiferapersiciformisC.Y.WuetT.L.Ming)进行生药鉴别研究,为芒果叶药材提供生药鉴别依据;
2.对芒果叶进行高效液相指纹图谱研究,为芒果叶药材的鉴别和质量控制提供科学依据;
3.对芒果叶及其混伪品扁桃叶进行ISSR指纹图谱研究,为芒果叶提供分子生药学鉴定实验依据。为进一步制定芒果叶药材质量标准提供科学基础,促进芒果叶药用资源的开发。
方法:
1.对芒果叶相关的国内外文献进行系统的检索和整理,了解国内外芒果叶的研究状况。
2.采用基原、性状和显微特征等鉴别方法,对芒果叶及其混伪品扁桃叶进行生药鉴别研究。
3.通过高效液相色谱法建立芒果叶药材指纹图谱,为其生药鉴别提供依据。首先选择稳定性好、色谱峰丰富的提取方法对样品进行提取,摸索并确定合适的色谱分离条件,并进行相关方法学考察,建立HPLC指纹图谱。对各个芒果叶品种进行对比分析,将得到的芒果叶HPLC对照图谱与其混伪品扁桃叶HPLC色谱图进行对比研究,探讨它们化学成分的异同。
4.采用ISSR分子标记技术对芒果叶及其混伪品扁桃叶进行分子生药学研究,筛选最佳的总DNA提取方法,通过ISSR-PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳对PCR反应条件进行优化,筛选出特异性扩增引物,鉴别芒果叶和扁桃叶,建立DNA指纹图谱。此外,还应用相关分析软件MVSP3.2和Popgene32,对各个样品进行聚类分析和遗传多样性分析。
结果:
1.文献研究:经科技查新,目前国内已有利用RP-HPLC法测定芒果叶中芒果苷含量以及在植物学方面利用ISSR、RAPD、AFLP等分子技术对芒果品种进行研究的文献报道,但没有发现对广西芒果叶药材进行HPLC指纹图谱、DNA指纹图谱及生药学研究的文献报道。
2.原植物鉴别:芒果的树干通常较弯曲,而扁桃的树干是笔直的。芒果叶通常为长圆形或长圆状披针形,侧脉20-25对,网脉不显;而扁桃叶狭披针形或线状披针形,侧脉约20对,侧脉和网脉两面突起。芒果的花序,苞片和萼片外面被微柔毛,而扁桃的花序无此特征,以上可以作为芒果叶生药鉴别的依据。
3.显微鉴别:扁桃叶柄皮层较窄,有大量的薄壁纤维存在,而芒果叶叶柄皮层中的纤维则主要分布于分泌腔上方呈半月形排列。另外扁桃的叶片、叶柄和叶枕中的维管束数量明显多于芒果。以上特征可以作为两者显微鉴别的依据。
4.芒果叶药材的HPLC指纹图谱的研究:通过对芒果叶HPLC指纹图谱的探讨,为芒果叶药材质量控制和生药鉴别提供了依据。本研究中首次用甲醇-0.05%磷酸为流动相,确定检测波长为275nm,柱温30℃。经方法学考察表明,建立的实验方法切实可靠,符合建立指纹图谱的相关规定。借助中药色谱指纹图谱相似度评价系统,共匹配得到7个共有物质峰。本研究还首次采用了双参照峰的方法对芒果叶的指纹图谱进行了研究,其中参照峰之一为芒果叶中重要的药效成分芒果苷,另外将保留时间约为77.7min的色谱峰作为另一个参照峰,共同表征芒果叶药材指纹图谱的特性。经过数据处理和图谱模拟,最终得到了芒果叶的对照图谱。通过比较芒果叶及其混伪品扁桃叶的高效液相色谱图,扁桃叶在30-50min几乎没有色谱峰,而芒果叶则有,可将二者区别开。
5.芒果叶药材的DNA指纹图谱研究:选用40条ISSR扩增引物,从中筛选出8条稳定性好、谱带清晰的引物。通过扩增共获得清晰的条带210条,其中多态性条带96条,扩增片段的多态性达到45.5%。通过UPGMA聚类分析可以将20个芒果叶样品及其混伪品扁桃叶鉴别之,ISSR是鉴别芒果叶及其混伪品扁桃叶的有效方法。本方法中引物UBC-851对扁桃叶不扩增,而对20个芒果叶品种均能产生多态性条带,可作为鉴别芒果叶及其混伪品扁桃叶的特异性鉴别引物,实现种间鉴别;而种内各个品种可以根据条带的数目和特异性位点加以区别,实现了芒果叶分子水平的鉴别。
结论:本研究创新点①对广西百色产芒果叶药材及其混伪品扁桃叶的显微结构(包括叶柄和叶枕)进行了显微鉴定;②采用双参照峰法对芒果叶药材进行高效液相指纹图谱鉴定研究,建立了芒果叶HPLC对照图谱;③对芒果叶药材进行ISSR分子生药学鉴别。结果表明:芒果叶与其混伪品扁桃叶的显微结构有差别,可以作为芒果叶生药鉴别的依据;HPLC-FPs实验结果反映出芒果叶中各种成分的差异,为芒果叶药材的质量控制和鉴别提供依据;通过ISSR指纹图谱研究,并结合遗传距离分析软件对8个引物扩增结果进行统计分析,证实芒果叶与混伪品扁桃叶遗传关系的差别,并得到了用于鉴别的特异性引物UBC-851,探讨了ISSR作为芒果叶分子生药学鉴别有效方法的实验过程。本文提供了芒果叶药材的生药学及分子生药学鉴别方法、HPLC指纹图谱评价的科学依据,为进一步制定芒果叶质量标准提供科学基础,促进芒果叶药材资源的开发。
本论文研究内容经过科技查新证实,目前尚未见与上述实验结果相同的文献报道。