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蜈蚣草是一种能够超富集砷的蕨类植物,具有特殊的砷转运、代谢途径,但由于蕨类植物的特殊性,目前对蜈蚣草砷超富集的分子机理的研究还存在困难。拟南芥作为一种模式植物,是研究非超富集植物砷转运、代谢很好的材料,然而迄今为止拟南芥砷转运的分子机制仍不清楚。因此探索蜈蚣草和拟南芥中砷转运相关基因并对其功能进行研究对于阐明植物砷吸收、转运和超富集的分子机制有重要意义,对于利用植物清除环境中的砷污染具有潜在的应用价值。
本论文利用原核表达、酵母功能互补和在拟南芥中过量表达等方法,对蜈蚣草中一个ABC Transporter家族的PvGCN1的基因功能进行了分析；同时克隆了拟南芥中胆酸盐转运蛋白家族的6个成员,并利用酵母功能互补、拟南芥T-DNA插入突变体对其在砷转运中的功能进行了初步研究。主要结果如下:
1.PvGCN1原核表达产物的酶活检测表明,PvGCN1蛋白具有ATP水解酶活性。对PvGCN1蛋白在不同重金属处理下结合ATP和水解ATP的活性检测结果表明:在AsⅢ或AsⅤ存在的条件下,PvGCN1蛋白结合和水解ATP的活性较对照增加2倍以上；而Cd2+、Cu2+和Co2+存在条件下,PvGCN1蛋白结合和水解ATP的活性较对照只增加了15％-50％。AsⅢ和AsⅤ能明显提高PvGCN1基因的ATPase活性,可能与该基因参与砷的转运有关。
2.将PvGCN1基因在野生型酵母和4个砷吸收转运的关键基因(负责砷泵出的ACR3,负责AsⅢ吸收的FPS1,参与AsⅤ吸收的PHO84,参与砷的液泡区隔化的YCF1)缺失的酵母突变株(⊿acr3,⊿fps1,⊿pho84,⊿ycf1)中表达,对转化子的砷吸收及其砷抗性实验结果表明:在相应的转运蛋白(FPS1或PHO84)的存在时,PvGCN1基因的表达可以促进转化子对AsⅢ或AsⅤ的吸收；由于酵母中没有类似蜈蚣草的较强的砷解毒能力,砷吸收增加的同时增加了转化子对砷的敏感性。这些结果暗示,PvGCN1基因参与AsⅢ和AsⅤ的吸收,并且是与AsⅢ和AsⅤ的转运蛋白协同作用的。
3.将PvGCN1基因在拟南芥中过量表达,对转基因植株砷抗性和吸收的实验结果发现:与野生型相比,过量表达植株对砷的敏感性增加,且砷含量明显增加。对拟南芥AtGCN1T-DNA插入突变体的表型分析表明:与野生型植株比较,突变体植株具有较强的砷抗性,并且突变体植株对砷的吸收量低于野生型植株。这些结果暗示,PvGCN1和拟南芥中同源的基因-AtGCN1,可能均参与了砷的吸收。
4.通过生物信息学的方法,初步确定了拟南芥中6个与大肠杆菌和酵母AsⅢ转运蛋白基因ArsB和Acr3p同源的基因,分别命名为AtACR3L1、2、3、4、5和6,其编码产物同属于胆酸盐转运蛋白家族。克隆这六个基因,并用酵母AsⅢ关键转运蛋白的突变体(⊿acr3、⊿fps1、⊿ycf1)对其功能进行验证。结果表明这六个基因在砷的转运中功能不尽相同:AtACR3L1的表达使⊿fps1母对AsⅢ变敏感,AsⅤ抗性略有提高；在⊿acr3酵母中的表达使酵母对AsⅢ和AsⅤ的抗性均有所提高。而AtACR3L2和AtACR3L6的表达使⊿acr3和⊿ycf1酵母AsⅢ抗性明显提高。AtACR3L4使野生型酵母AsⅢ抗性明显提高。AtACR3L5表达明显提高⊿acr3酵母突变体AsⅢ抗性。我们推测AtACR3L1可能参与AsⅢ胞内胞外的双向转运及液泡砷的区隔化；AtACR3L2可能参与了砷从胞内的泵出和液泡区隔化；而AtACR3L4、5和6可能仅参与了砷从胞内向胞外的转运。
5.对AtACR3L1基因的功能做了进一步研究。测定表达AtACR3L1基因的⊿acr3和⊿ycf1酵母细胞砷吸收的情况发现:,⊿fps1酵母表达AtACR3L1基因后对AsⅢ变敏感,且砷吸收增加,同时对AsⅤ的抗性略有提高AsⅤ处理时砷的积累也略有增加；而AtACR3L1转入⊿acr3酵母后,酵母AsⅢ和AsⅤ的抗性和吸收均有所增加。对AtACR31蛋白结构分析发现,它具有8个跨膜结构域是跨膜蛋白,我们推断AtACR3L1可能同时参与了AsⅢ的吸收和砷的区隔化。鉴定了AtACR3L1基因T-DNA插入功能缺失突变体的纯系。与野生型相比,突变体对AsⅢ及AsⅤ的抗性有所提高,AsⅢ处理时突变体地下部分砷吸收量增加,AsⅤ处理时地下部分砷吸收量减少,而地上部分砷吸收均无明显变化。这说明AtACR3L1基因在植物中和砷的转运相关,但具体功能需要实验进一步验证。