论文部分内容阅读
目的本课题以食管癌TE10细胞株和食管癌病理标本为研究对象，观察TLR9在食管癌细胞和组织中的表达、TLR9激动剂(Cytosine phosphate guanosine oligodinucleotide,CpG ODN)，抑制剂氯喹（chloroquine, CQ）对食管癌细胞TE10增殖活性和癌细胞迁移的影响，探讨TLR9的表达与食管癌临床病理特征的相关性，为食管癌的临床免疫治疗提供新的思路和策略。方法（1）RT-PCR法测定食管癌细胞TE10TLR9mRNA的表达，采用Western-blot方法和流式细胞术（FCM）检测其TLR9蛋白表达。（2）用TLR9的非特异性抑制剂CQ10μM预处理TE10细胞1h后再加10μg/mL CpG ODN分别作用于TE10细胞12h、24h和48h后，MTT法检测食管癌细胞的增殖活性。（3）运用RT-PCR法检测TLR9激动剂/抑制剂对TE10细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproyeinse, MMPs)MMP-2mRNA、MMP-7mRNA和环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）mRNA表达的影响。（4）细胞划痕实验观察TLR9的表达在食管癌细胞迁移中的作用。（5）采用ELISA方法检测CpG ODN对TE10细胞分泌核因子-κB（NF-κB）p65水平的影响。第二部分：收集临床上未经化疗和放疗的食管癌标本60例，行组织分型和临床分期，同时取癌旁组织30例（均证实无癌细胞），行常规石蜡包埋、切片，免疫组化法（SP法）检测食管癌组织和癌旁组织TLR9的表达，分析TLR9的表达与食管癌临床病理特征的相关性。结果（1）RT-PCR法检测到食管癌细胞TE10上有TLR9mRNA的表达，Western-blot方法和流式细胞术观察到TE10细胞表达TLR9蛋白。（2）MTT法结果表明，CpG ODN作用TE10细胞24h和48h均能显著促进TE10细胞的增殖，而经CQ预处理的TE10细胞未见CpG ODN促进癌细胞增殖的作用。（3）RT-PCR检测结果显示，CpG ODN可促进TE10细胞MMP-2mRNA、MMP-7mRNA和COX-2mRNA的活性表达，且作用的同一时间段内具有量-效关系。（4）细胞划痕实验结果表明CpG ODN可促进TE10细胞的迁移，且具有量-效关系。（5）ELISA方法检测到20μg/mL CpG ODN作用TE10细胞的12h和24h均能促进、提高其分泌NF-κB p65的水平。第二部分：SP法检测食管癌组织和癌旁组织中均有TLR9的表达，食管癌组织TLR9蛋白表达阳性率显著高于癌旁组织（P<0.05）；食管癌组织中TLR9的表达与食管癌组织的分化程度、肿瘤大小、部位及TNM分期密切相关(P<0.05)，而与患者的年龄、性别、淋巴结转移无明显相关性（P>0.05）。结论（1）TLR9参与了食管癌的发生：在食管癌细胞和组织均高表达TLR9，且TLR9的激动剂CpG ODN显著促进TE10细胞的增殖。（2）TLR9的表达及其介导的信号通路参与了食管癌的进展。（3）TLR9与食管癌的临床病理特征关系密切：TLR9的表达与食管癌的分化程度、肿瘤大小、部位及TNM分期密切相关(P<0.05)。故本团队推测，TLR9参与了食管癌细胞的增殖与迁移，TLR9介导的信号通路在食管癌的发生、发展中有重要作用。