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近年来,有关几丁质及其降解产物如几丁寡糖、壳聚糖等的研究与开发在国内外引起了普遍关注,它们在医药、食品、环保等众多领域显示出广阔的应用前景。采用生物酶降解法生产几丁寡糖、壳聚糖已成为理想的途径,它与化学生产法相比具有反应条件温和、不污染环境等特点。许多微生物都能产几丁质酶,但只有部分在实际中得到应用,主要原因是菌株的产酶能力太低。因此筛选出产酶活力高、稳定、潜力大等具有多种优良特性的菌株是解决实际应用问题的一条重要途径。
本文从海洋产几丁质酶菌株的分离、筛选、菌株的鉴定、几丁质酶基因的克隆、几丁质酶的分离和性质研究以及酶蛋白的分析等几个方面进行了系统研究,结果如下:
通过透明圈筛选法,从南海海域采集的样品中,分离到38株产几丁质酶的菌株,其中32株细菌、5株放线菌和1株真菌。选取了其中1株编号为C203的菌株作为供试菌株,该菌产酶能力较强并且在底物中存在葡萄糖时依然产酶。通过对其16S rDNA序列、形态及生理生化特征进行分析,鉴定出C203属于链霉菌属(Streptomyces),可能是来自海洋环境的一个新种,并构建了其系统发育进化树。
对菌株C203液体发酵工艺和培养基组成进行了优化。实验考察了碳源、氮源、无机盐、pH值及接种量等对C203产酶活性的影响,并通过正交实验对培养基配比进行了优化。确定其最佳培养基组成及发酵条件为:胶体几丁质(w/v为1%)20%(v/v),葡萄糖0.5%,酵母膏0.3%,K2HPO<,4> 0.04%,陈海水配制,初始pH值7.0~7.2,种龄48h,接种量5%,28℃,200r/min培养6d。
菌株C203产酶发酵液离心后的上清液经透析、真空浓缩、再通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳得到一有几丁质酶活性的条带,回收此活性条带,再利用SDS-PAGE电泳分析,得出其分子量约为44KD。通过对该几丁质酶理化性质进行研究后发现:该酶的最适作用温度为60℃:最适pH值为7.2;Mg<2+>和Fe<2+>对酶活性有一定的促进作用,而Cu<2+>和Zn<2+>则能强烈抑制其活性:最适底物浓度为1%的胶体几丁质。
通过对微生物产几丁质酶基因家族进行分析,设计了一对保守引物。利用这对引物,以菌株C203基因组DNA为模板,克隆到一段长度为609bp的几丁质酶基因保守序列。然后再通过设计一系列的随机引物(AD引物)和特异引物(SP引物),利用TAIL-PCR技术,分别克隆到该保守片段两端的侧翼序列,经拼接后获得一段总长度为1563bp的基因序列,经BLAST分析发现和该基因碱基序列同源性最高的是菌株S. thermoviolaceus的产几丁质酶基因(Chi40),同源性为84%。将该基因序列输入NCBI的ORF查找器进行阅读框架分析,结果发现该序列包含一个从234~1484bp,长度为1251bp,编码416个氨基酸的几丁质酶基因开放阅读框。将翻译后的氨基酸序列进行BLAST分析,结果表明和该氨基酸序列同源性在80%以上的都是微生物产生的几丁质酶,最高的是菌株S.aureofaciens产的几丁质酶,同源性为83%。利用DNAMAN软件对菌株C203几丁质酶的疏水性、亲水性、等电点和分子量等性质进行了分析,同时还预测了其二级结构,结果显示该蛋白的等电点为5.86,分子量为44208.8。