论文部分内容阅读
中重度以上急性放射病（acute radiation sickness，ARS）患者常因造血衰竭、免疫功能低下继发严重感染、脏器辐射损伤所致多脏器衰竭而死亡。由于造血干细胞移植技术的完善以及细胞因子的广泛应用，使放射病患者造血功能恢复成为可能；但免疫功能低下和多脏器衰竭仍然是危及这类患者生命的主要因素。胸腺是中枢免疫器官，由骨髓迁入的淋巴祖细胞在这里分化、发育成为成熟的T细胞后输出到外周淋巴组织，対机体免疫功能的维持和调节起着不可低估的作用。但胸腺也是对辐射高度敏感的器官，在中重度以上ARS发生时常被累及而影响机体的免疫功能。因此，及时修复损伤的胸腺能有效改善放射病患者的免疫功能。骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSC）来源于中胚层，可横向或跨胚层向多种组织分化，参与损伤组织脏器的修复；同时，MSC还能维持胸腺基质微环境，与胸腺上皮细胞协同作用，促进T细胞成熟。能否用MSC修复放射损伤的胸腺、恢复机体的免疫功能，目前相关的报道不多，本实验将就这一问题进行研究。目的本实验利用60Coγ射线照射后建立的胸腺放射性损伤小鼠模型，研究增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因修饰的MSC対胸腺放射损伤的修复作用和机制，为中重度以上ARS的救治探索新的途径。方法1.用全骨髓细胞贴壁法分离纯化雄性C57小鼠骨髓MSC，并改良培养条件，体外培养、扩增、传代，待细胞传至第二代，通过细胞形态、细胞表型和成骨、成脂实验，来验证所获细胞是否为实验需要的MSC。2.通过腺病毒转染技术，用含有报告基因EGFP的穿梭质粒和pAdxsi载体构建重组腺病毒载体质粒，转染H293细胞并扩增，构建表达EGFP的重组腺病毒（pAdxsi-EGFP），纯化后以TCID50法（50%tissue culture infective dose）测定病毒滴度。然后将构建的重组腺病毒以0、50、150、300四种感染复数（Multiplicity ofinfection，MOI）感染鉴定正确的MSC，用荧光显微镜和流式细胞仪检测感染率，确定最佳MOI，并以CCK-8（Cell counting kit-8）法检测感染后MSC的增殖活性。3.以不同剂量60Coγ射线照射雌性BALB/C小鼠制作胸腺放射性损伤模型。以6Gy、9Gy、12Gy三个剂量经前胸野单次照射小鼠纵膈，其余部位以10cm铅板遮蔽，剂量率为154.7cGy/min，动物距放射源80cm，照射时长分别为6Gy：257秒；9Gy:386秒；12Gy:514秒。照射后观察小鼠体重、进食水量、胸腺指数、胸腺病理、食管、气管、肺的病理、外周血像、胸腺T亚群和外周血T亚群变化,判断模型是否构建成功,并选择最佳照射剂量，然后以此剂量照射小鼠构建胸腺放射损伤模型。4.用构建的基因修饰MSC经尾静脉输注到胸腺放射性损伤模型小鼠体内，观察小鼠体重、胸腺指数、胸腺病理、外周血像、胸腺T亚群和外周血T亚群、胸腺T细胞重排删除环（T cell receptor rearrangement excision circles，TREC）、外周血细胞因子的变化以及胸腺Y染色体性别决定区（Sex-determining Region ofY-chromosome,Sry）的表达情况，判断MSC対胸腺放射性损伤的修复及对机体免疫功能恢复的作用和机制。结果1.在倒置显微镜下观察，体外分离培养的MSC在接种24小时后开始贴壁，起初形状多为小圆形及多角形，培养至第7天多数细胞伸展呈梭形并呈集落式生长，传代培养至第2代时细胞形态趋于统一，呈现为长梭形细胞束装排列。流式细胞仪检测第二代MSC细胞表型，高表达CD105（69.01%）、CD44（95.65%），低表达CD34（0.76%）、CD45（5.37%）。成骨诱导3周后以Von Kossa染色，可见染色阳性的骨结节；成脂诱导后2周可见油红O染色的红色脂肪细胞。2.将重组穿梭载体质粒pAdxsi-EGFP用Xho I酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳可见7条大小分别为14K、11.8K、3.1kb、2.66kb、2.47K、1.45K、0.6K条带，而单纯pAdxsi经Xho I酶切、电泳后仅有14kb,11.8kb,4.0kb,2.47kb,1.45kb,0.6kb6条带。然后在H293细胞中扩增、纯化后以TCID50法测定病毒滴度为2×1010pfu/ml。用构建的重组腺病毒感染MSC，感染后10小时可见绿色荧光表达，随时间推移逐渐增强，第7天后表达率达最高并趋于稳定，体外培养28天仍可见荧光；且感染率随MOI的增加而增加，但MOI为300时细胞形态变化较明显，表现为较多细胞变形、漂浮，提示细胞受损，MOI为150时，感染率较高，且细胞形态变化不大。经流式细胞仪检测四组感染率分别为7.4%、65.7%、92.3%、94.6%。以MOI150感染MSC后，与未感染MSC相比，CCK-8法检测两者增殖活性无差异（P﹥0.05）。3.三个剂量照射组在照射后各个时间点体重均低于对照组，但6Gy照射组仅在第14天与对照组相比有差异（P<0.05），9Gy照射组在照后第14、21天与对照组相比有差异（P<0.05），而12Gy照射组在照射后第14、21、28天与对照组有差异（P<0.05）。照射后1周内平均每日进食量和饮水量，6Gy及9Gy两组与对照组无差异（P>0.05），12Gy组与对照组相比有差异（P<0.05）。三个剂量照射组在照后各个时间点胸腺指数均低于对照组；6Gy组在照后第14、21、28天与对照组相比有差异（P<0.05）；9Gy与12Gy照射组在照后第7、14、21、28天与对照组相比有差异（P<0.05），其中第21、28天差异更显著（P<0.01）。病理组织学显示照射组小鼠胸腺萎缩，皮质区淋巴细胞变性坏死，出现较多细胞碎片，髓质区胸腺小体消失，细胞数量减少，尤以照射后第7天较明显，且损伤程度与放射剂量呈正相关；照射后第14天，胸腺细胞数量逐渐增加，胸腺体积逐渐增大，但照射后28天仍未恢复正常。12Gy照射组部分小鼠食管、气管病理显示黏膜基底层细胞增多，血管充血，上皮层部分坏死脱落，固有层、黏膜下层可见炎细胞浸润；其余两组食管、气管、肺病理未出现放射损伤。三个剂量照射组外周血白细胞计数和淋巴细胞计数在照射后低于对照组，照射后第7天降到最低，其后逐步升高，但至照射后28天仍未完全恢复正常，在照射后各个时间点上与对照组相比有显著性差异（P<0.01）；6Gy与9Gy两组无差异，12Gy组在照后第7天和第14天与6Gy、9Gy两组比有差异（P<0.05）。对照组胸腺CD4+CD8+细胞比例大约70%，CD4+CD8-细胞比例约为20%，CD4-CD8+细胞比例约为7%，而CD4-CD8-细胞仅占2%左右。照射后，CD4+CD8+细胞下降幅度最大，最低可降至照射前的十分之一，照射后第14天，比例逐渐恢复，但至照后28天也未恢复到照射前水平。CD4-CD8-细胞则于照后出现大幅度升高，在照射后第7天升至最高，幅度最大者接近60倍，其后逐步回落，但至照后28天也明显高于照射前水平。CD4+CD8-和CD4-CD8+细胞比例在照射后出现下降，在照射后第14天降至最低，然后逐渐回升。对照组外周血中CD3+细胞比例在40%左右，CD3+CD4+细胞比例约为30%，而CD3+CD8+细胞比例约为10%，CD4/CD8约为3.0。照射后第1天，照射组各群细胞的比例短暂升高后下降，在照射后第14天，CD3+细胞比例回升，其后再次缓慢下降；CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞的比例和CD4/CD8的值则持续下降，但从第14天起，下降的幅度明显减小。三个照射组的胸腺和外周血T亚群变化趋势相同，但随着照射剂量的增大，各亚群的变化幅度增大。4.对照组和对照+MSC组在各指标上无差异（P>0.05）。照射组与照射+MSC组除了Sry检测结果外，其余各指标变化趋势一致（变化趋势见结果3），但照射+MSC组要优于照射组，且两者差异有统计学意义；同时照射+MSC组与对照组也有差异。荧光病理显示输注MSC后1天胸腺出现绿色荧光，但仅在血管周围表达，随着时间的推移，荧光逐渐弥漫至整个组织，在第7天表达达高峰，其后逐渐减少，至35天基本消失。照射+MSC组IFN-γ、TGF-β血清含量明显增高，与照射组及对照组比较差异有统计学意义，IL-4浓度与照射及对照组无差异。Sry检测除照射+MSC组在照射后14及28天为阳性外，其余各组均为阴性。结论1.用全骨髓细胞贴壁法并改良培养条件后培养的细胞从形态、细胞表型及多向分化能力三个方面鉴定，是实验所需的骨髓间充质干细胞。2.用构建的重组腺病毒以最佳MOI为150感染MSC后，MSC能稳定、高效表达EGFP，并且不影响细胞的增殖活性，通过腺病毒为载体导入外源基因可成功获取基因修饰的MSC。3.6Gy、9Gy、12Gy三个剂量均可引起小鼠胸腺的放射性损伤，但9Gy照射后胸腺改变较典型，且无其它脏器损伤，用此剂量单次照射小鼠纵膈可成功构建小鼠胸腺放射性损伤模型。4.用基因修饰的MSC治疗胸腺放射损伤小鼠模型，MSC可归巢至胸腺并增殖，参与胸腺的修复，减轻胸腺的辐射损伤，并能有效恢复机体受损的免疫功能，可做为治疗急性放射病的一条新途径。