论文部分内容阅读
生长因子受体结合蛋白2(Growth factor feceptor bound protein2，Grb2)是包含SH2功能域的接头蛋白，它在致癌基因Ras的信息传导途径中起着关键的作用，目前被广泛认为是抗肿瘤药物设计的优秀靶标。本文以噬菌体库展示得到的无磷酸环肽配体GITE为先导化合物，基于前期构效关系研究结论，围绕关键结构残基酪氨酸和关键构象诱导残基α，α-双取代氨基酸的优化，设计合成了一系列G1TE(cycIo(CH2COGlu-2-Leu-1-Tyr0-Glu+1-Asn+2-Val+3-Gly+4-Met+5-Tyr+6-Cys+7)-amide)类似物，以提高活性、降低肽的特征，发展具有细胞内活性的Grb2-SH2拟肽抑制剂。
根据G1TE与Grb2-SH2的结合模式，笔者设计在酪氨酸的3’-位引入具有不同电子效应的取代基，以增强配体与蛋白质口袋中Arg86和Arg67的作用。合成了多种适用于固相合成的正交保护的酪氨酸衍生物，并把它们构建到只包含5个氨基酸残基的序列中，得到了一类全新的Grb2-SH2非磷酸抑制剂。该类抑制剂具有结构简单、电荷数低、肽特征少的特点。其中含有3’氨基-酪氨酸残基的(R)-亚砜环合的类五肽95b与Grb2-SH2蛋白的结合活性最强(IC50=58nM)，并且对Grb2高表达的肿瘤细胞MDA-NB-453的生长显示强效抑制活性(IC50=19nM)，是迄今报道的细胞活性最强的非磷酸Grb2-SH2抑制剂。
α，α-双取代氨基酸能诱导肽链的β-turn结构，为了获得既诱导构象又参与蛋白质口袋结合的结构和功能双重氨基酸，我们设计将酸性侧链引进到α-位，合成了带有羧酸边链的α，α-双取代氨基酸，并将它们构建到环肽中。结果表明，本文设计的α，α-双取代氨基酸能够诱导环肽形成310右手螺旋的二级结构，并同Grb2-SH2的磷酸配体结合口袋发生多个范德华作用。
为了进一步简化分子结构，我们在95b的基础上设计合成了小环和开链的Grb2-SH2抑制剂。结果显示过分刚性的小环结构抑制剂不利于配体和蛋白相互作用，而经过修饰的开链肽却能够表现良好的生物活性。
为了揭示非磷酸GRB2-SH2环肽抑制剂的独特作用机理，笔者采用NMR方法研究了不同构型的手性亚砜桥键的环肽cyclo-[CH2CO-Gla-L-Y-N-V-G-NPG-Y-(R/S)C(O)]-amide在溶液中的构象。研究表明，两种异构体均采取β-tum构象，R构型采取相对伸展的、刚性的结构，骨架呈圆环状，有较大的亲水表面接触靶蛋白：S构型由于一些关键残基侧链隐藏在分子内，分子结构较为紧密，减少了与靶蛋白接触的几率，因此R构型的化合物与蛋白的结合活性高于S构型。