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海湾扇贝Argopecten irradian Lamarck自1982年由美国引种到我国以来由于生长周期短、经济效益高已成为我国最主要的养殖贝类之一。然而,养殖区水质恶化、气候骤变及疾病爆发等使海湾扇贝养殖业面临诸多困境。深入开展海湾扇贝功能基因方面的研究,尤其是抗逆相关基因及其作用机制的研究并寻找有效防治扇贝疾病的途径对贝类养殖业的可持续发展有极其重要的意义。贝类受到外界病原或各种压力胁迫刺激时,一个重要免疫应激反应就是吞噬作用,同时产生多种活性氧分子,依靠其极强的反应特性,实现对入侵病原的杀灭。这种机制不具特异性,因而也会破坏生物体本身的核酸、蛋白分子等,发生细胞凋亡,对机体造成严重的伤害。所以及时清除贝类体内过量产生的活性氧分子抑制非正常细胞凋亡,对提高机体抵抗力和免疫力具有重要的作用。本文主要针对抗氧化酶系统中过氧化氢酶和两种过氧化物还原酶基因进行了克隆和结构特征分析,研究其组织分布及受到菌刺激后转录水平的表达变化并对过氧化物还原酶6进行了体外原核重组表达。此外,克隆了细胞凋亡过程中的重要分子细胞程序性死亡蛋白4基因并进行了分析。采用同源克隆方法和RACE技术,从海湾扇贝血细胞中克隆得到了两种过氧化物还原酶基因,通过多序列比对确认为PrxⅤ和PrxⅥ。PrxⅤ基因的cDNA全长1689bp,其中开放阅读框为567bp,编码188个氨基酸,推导其编码蛋白的分子量为19.9kDa,理论等电点为7.49。与栉孔扇贝Chlamys farreri的相似度为78%,与文昌鱼Branchiostoma belcheri tsingtauense相似度为61%,与鱼类、两栖类、哺乳类的相似度在50%左右。该基因由6个外显子和5个内含子构成全长12575bp。基因长度与其它物种相比较大,基因结构与脊索动物相似而明显区别于节肢动物。转录水平上,在血细胞、肌肉、鳃、性腺、肝胰脏中均有分布,其中鳃的表达量最高。鳗弧菌注射刺激后,表达量随取样时间呈升高趋势,维持高水平较长时间后恢复。在15h、30h时,与对照组表达量存在显著差异。PrxⅥ基因的cDNA全长1657bp,开放阅读框为660bp,编码219个氨基酸,其编码蛋白预测分子量为24.3kDa,理论等电点为5.97。PrxⅥ蛋白序列十分保守,与海兔Aplysia californica、皱纹盘鲍Haliotis discus discus等其它软体动物的相似度为64%-71%,与哺乳动物的形似度为62%。已分析该基因DNA长度约10K,拼接后推测是由6个外显子和5个内含子构成的。转录水平上,在各组织均有分布,其中肝胰脏的表达量最高,鳃中也有较多的表达。荧光定量PCR结果显示菌刺激后血液中PrxⅥmRNA稍有降低后逐渐升高,随后降低,又存在波动。此外,应用pET-28系统对该基因进行了体外原核重组表达,实验结果表明37°C蛋白表达量极低,而20°C明显表达,不同IPTG浓度对蛋白表达量影响不明显。利用根据其他生物过氧化氢酶保守氨基酸序列设计的简并引物,结合RACE技术从海湾扇贝鳃中得到过氧化氢酶基因catalase。该基因cDNA长1912bp,开放阅读框1500bp,编码499个氨基酸,其中包括RLLSYSDT血红素结合位点、FNRERIPERVVHAKGAG酶活性位点,以及2个糖基结合位点。过氧化氢酶推导分子量为56.6kDa,理论等电点为6.90。海湾扇贝过氧化氢酶与其它物种的相似度很高,与哺乳动物的相似度也高达68%。该基因总长5356bp,由10个外显子和9个内含子,其中1个内含子紧随终止密码子TAG位于3’非编码区。CAT mRNA也是组成型分布于各组织中,其中肝胰脏和鳃中的表达量最高。菌刺激后血液中CAT mRNA稍有降低后逐渐升高,在23h水平达到最高随后逐渐恢复。通过RACE技术所获得的细胞程序性死亡蛋白4(PDCD4)基因cDNA长1839bp,其中开放阅读框1371bp,编码456个氨基酸。海湾扇贝PDCD4蛋白约50.9kDa,理论等电点5.20。该蛋白被预测定位于核纤层,结构包含了两个保守的MA-3α螺旋结构域,能够参与蛋白间的相互作用。