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副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis, HPs)引起猪的一种常见的细菌性疾病,该病在我国的流行越来越广泛,给我国养猪业造成了较大的经济损失,快速准确诊断和掌握流行病学规律对指导该病的防控非常重要。针对现有方法的不足,本研究建立了一种检测HPs的PCR方法,并运用该方法对四川地区HPs进行了分子流行病学调查,掌握了近期四川地区HPs的流行与分布、部分基因的分子进化特征,为四川地区开展该病的防控监测、流行风险分析、HPs基因数据库的建立及疫苗研制等奠定了基础。1.副猪嗜血杆菌0MP P2基因PCR检测方法的建立本研究参照Genbank公布的HPs外膜蛋白P2基因,选择其保守区域设计针对所有血清型HPs的PCR通用检测引物,通过对退火温度、引物浓度等条件的摸索优化,成功建立了PCR快速检测方法,将标准菌株HS80 PCR产物序列进行测定和比对,结果表明序列同源性达97%-99%,证明了该PCR方法对靶序列克隆的准确性。再以15个血清型的HPs标准菌株和链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、丹毒杆菌等7种参考菌株对该方法的特异性和重复性进行了验证,结果显示该方法特异性强重复性好,且可检测到15个血清型的HPs菌株。灵敏性结果表明最低检测量为173 CFU,灵敏性较高。同时,研究结果还表明该方法可快速准确检测临床疑似HPs病料。综上所述,本研究建立的PCR方法特异性强、灵敏性高、重复性好,可用于对临床疑似分离菌株的鉴定,也可用于HPs的分子流行病学调查。2.四川地区HPs的分子流行病学调查本研究于2013年6月至2013年12月期间在四川省成都、绵阳、乐山、眉山、雅安、广安、南充、德阳等17个市县20多个规模化猪场收集疑似HPs病料131份,运用所建立的PCR方法进行检测,累计检出阳性病料26份,检出率19.8%,阳性样品均检出于断奶前后和保育阶段病猪,来源地覆盖了11个地区,表明HPs已在四川多个地区广泛流行,主要危害断奶前和保育阶段的猪群,所以对该病的防控应给予高度的重视。通过对从阳性病料中分离的12株HPs和本室2009年分离的HPs的SC01株进行espp2基因克隆测序,并进行这13条序列核苷酸同源性、推导氨基酸同源性及其差异位点和遗传进化树构建等分子特征分析,结果表明13株四川HPs分离株被分为两个基因类群,且在核苷酸和氨基酸序列上具有高度的同源性。由此表明四川地区流行的HPs菌株基因型总体差异不大,同源性较高。综上所述,HPs已在四川地区广泛分布与流行,主要危害断奶前和保育阶段的猪群,四川地区流行的HPs菌株在病原分子角度具有较高的同源性,本研究为指导四川地区科学防控HPs具有重要的指导意义。