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第一部分携带hVEGF165基因和EGFP报告基因的重组腺相关病毒表达载体的构建目的构建携带人血管内皮生长因子(hVEGF165)基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的重组腺相关病毒载体。方法将含报告基因EGFP的真核表达质粒pDC316-IRES-EGFP与包含目的基因hVEGF165的真核表达质粒pSNAV-hVEGF165进行重组，得到重组质粒pSNAV-hVEGF165-IRES-EGFP。酶切PCR鉴定和测序后，应用AATMaxTM包装系统复制和包装2型腺相关病毒重组体，纯化后进行滴度检测和PCR鉴定。结果酶切后PCR鉴定及DNA序列分析证明，目的基因VEGF165基因和报告基因EGFP基因序列成功重组到pSNAV质粒中，获得了pSNAV-hVEGF165-IRES-EGFP重组质粒。AATMaxTM包装系统成功复制和包装了rAAV2-hVEGF165-IRES-EGFP重组腺相关病毒表达载体，经纯化后滴度为1×1011v.g.／ml，PCR鉴定能够表达目的基因片断。结论成功构建了携带目的基因hVEGF165和报告基因EGFP的rAAV2-hVEGF165-IRES-EGFP重组腺相关病毒载体。为下一步组织工程种子细胞转染目的基因hVEGF165奠定了基础。第二部分重组腺相关病毒介导hVEGF165基因体外转染先天性小耳畸形残耳软骨细胞的实验研究目的应用重组腺相关病毒rAAV2-hVEGF165-IRES-EGFP转染体外培养的先天性小耳畸形残耳软骨细胞，检测转染率和hVEGF165表达情况。方法体外分离、培养先天性小耳畸形残耳软骨细胞，细胞传至第二代时按不同处理因素分为3组：未转染组（Ctr组），转染空载体rAAV2-IRES-EGFP组（Exp1组）和转染rAAV2-hVEGF165-IRES-EGFP组（Exp2组）。于转染24小时、48小时、72小时和7天时，应用MTT法检测3组软骨细胞的增殖情况。并于上述时间点，在倒置荧光显微镜下观察Exp2组细胞绿色荧光蛋白表达情况，计算转染效率。应用RT-PCR检测3组细胞VEGF165 mRNA表达情况，ELISA法检测培养液上清中VEGF蛋白含量。结果MTT法检测表明3组软骨细胞的增殖无明显差别。倒置荧光显微镜下，可见Exp2组细胞在转染VEGF165基因24小时即有绿色荧光，但荧光较弱，阳性细胞率为6％。之后荧光逐渐增强，到48小时阳性细胞率增加为9％，72小时为13％，7天时达到41％。RT-PCR检测结果表明，在同一时间点Exp2组软骨细胞hVEGF165 mRNA水平均明显高于Exp1组和Ctr组，而Exp1组和Ctr组之间无显著性差异。ELISA法检测结果显示，3组培养液上清中的VEGF蛋白含量均呈时间依赖性升高，72小时达分泌顶峰，7天时仍维持在较高水平；在同一时间点，Exp2组VEGF水平均明显高于Exp1组和Ctr组，但Exp1和Ctr组之间无显著性差异。结论2型重组腺相关病毒介导的hVEGF165基因能够安全有效转染先天性小耳畸形残耳软骨细胞；转染后的软骨细胞VEGF的mRNA表达和蛋白分泌水平明显增加。第三部分rAAV2-VEGF165-IRES-EGFP转染先天性小耳畸形残耳软骨细胞体内构建组织工程化软骨的实验研究目的将2型重组腺相关病毒介导的hVEGF165转染的先天性小耳畸形残耳软骨细胞与可注射性支架材料—Pluronic F-127复合后，植入裸鼠体内观察新生软骨的构建情况，探讨hVEGF165基因转染能否促进种子细胞存活、改善组织工程软骨的组织结构。方法分离、培养先天性小耳畸形残耳软骨细胞，取第二代软骨细胞，将rAAV2-VEGF165-IRES-EGFP转染第二代软骨细胞，取转染后的细胞和未转染的细胞以5.0×107个／ml的终浓度悬浮于30％的Pluronic F-127（4℃）中。将2组细胞—Pluronic-F127复合物皮下注射到裸鼠背部皮下两侧，一侧注射转hVEGF165基因细胞复合物（Exp组），对侧皮下注射未转hVEGF165基因组复合物（Ctr组），每侧0.5ml。8周后进行新生组织的大体观察、湿重比较和组织学检测：HE染色观察细胞基本形态和组织结构；Masson三色染色观察胶原纤维；Verhoeff铁苏木素染色法观察弹性纤维；甲苯胺兰染色观察软骨组织的异染程度及基质酸性粘多糖含量；VEGF免疫组化染色观察VEGF表达情况，采用IPP5.0图像分析软件测量AIOD值进行比较。结果未转染组形成的组织工程化软骨平均湿重为58.5 mg，转染组形成的组织工程化软骨平均湿重为127.4 mg，较未转染组明显增加。两组新生组织表面均未观察到明显的毛细血管网形成。组织学染色表明二者的组织结构无明显区别，表现为软骨陷窝明显、软骨细胞略大于正常软骨、排列疏松；能分泌嗜碱性软骨基质；弹性纤维数量少、着色深浅不一；胶原纤维较多；软骨内部有大量的纤维结绨组织长入。VEGF免疫组化染色经图像分析表明转染组高于未转染组，AIOD值分别为173.67±21.56、149.83±10.17，差异显著（n=6，p＜0.05）。结论先天性小耳畸形残耳软骨细胞转染hVEGF165基因能够促进部分细胞早期存活，增加组织工程软骨的大小和重量，但不能改善其组织结构。