论文部分内容阅读
由Dickeyazeae(异名为菊欧文氏杆菌玉米致病变种Erwinia chrysanthemi pv.zeae)引起的水稻细菌性基腐病是水稻上危害较严重的细菌病害之一，该病害在我国和东南亚国家的局部稻区严重发生，造成水稻严重减产。近来的研究发现D.zeae能产生毒素Zeamine，该毒素能抑制水稻种子发芽并引起水稻秧苗致萎；而侵染双子叶植物的D.chrysanthemi则不产生抑制水稻种子发芽的毒素，表明毒素Zeamine可能是D.zeae的重要致病因子之一。
本研究用Tn5转座子插入突变的方法获得了水稻细菌性基腐病菌株EC1突变体库，通过毒素生物测定筛选获得了毒素缺失突变体Em54、Em67和Em76以及毒素调控基因突变体Ew26、Ew30和Ew34。通过TAIL-PCR方法获得了这6个突变体的Tn5插入侧翼序列和突变基因的全序列。
Em54、Em67和Em76均突变在同一个基因中，该基因全长7，041bp，编码2，346个氨基酸，经BLASTp比对，发现该基因编码的蛋白与Photorhabdus asymbiotica subsp.asymbiotica ATCC43949的β-酮酰合成酶有58％的同源性，后续试验证明，该基因参与合成新型的聚多胺抗生素Zeamine，因此将该基因命名为zmsA(Zeaminesynthase)。该基因具有PKS的模块结构，其结构域顺序为：β-酮酰合成酶(β-ketoacylsynthase，KS)-酰基转移酶(acyl transferase，AT)-酰基转运蛋白(acyl carrier protein，ACP)-β-酮酰还原酶(β-ketoacyl reductase，KR)-羟脂酰脱水酶(hydroxyacyl dehydratase，DH)。zmsA突变体失去抑制水稻种子萌发的能力，同时对马铃薯和大白菜的致病力也大大降低。研究结果证实了zmsA与单双子叶植物的致病性密切相关。
Ew26、Ew30和Ew34突变体目的基因的突变使Zeamine的产生量降低，其中，Ew26突变在一个长为1，050bp的基因中，编码349个氨基酸，BLASTp比对结果与D.dadantii3937的PhoQ有98%的同源性，且Tn5插入在该基因的第766个碱基处，转座子插入同时影响下游基因Cupin4家族基因的表达。Ew30突变在一个长为1，320bp的基因中，编码439个氨基酸，BLASTp比对结果与D.dadantiiEch586的多感应信号传导组氨酸激酶有99%的同源性，且Tn5插入在该基因的第200个碱基处，将该基因命名为ntrE。Ew34突变在两个转录方向相反的基因之间，上游基因339bp，编码112个氨基酸，与D.dadantii Ech586的一个未知功能蛋白DUF413有99%的同源性，下游基因828bp，编码275个氨基酸，与D.dadantii Ech586的一个LysR家族的转录调节子有99%的同源性。实验结果表明，在Ew34中，转座子的插入使lysR基因的表达上调了。进一步互补实验和表型分析证明了Cupin4、NtrE和LysR调控致病因子的产生，包括4种胞外酶Prt、Pel、Peh和Cel的生物合成或分泌。
为了深入研究水稻基腐病菌的分子致病机理，弄清涵盖整个菌株的致病因子，本研究还对D.zeae EC1菌株进行全基因组测序，结果表明：D.zeae EC1菌株的全基因组核苷酸大小为4，532，364bp，GC%为53.43%;含有4，154个基因，基因覆盖率为85.77%，基因的平均长度为935bp;重复序列占基因组的0.69%;Non-coding RNA预测结果表明，tRNA有88个，rRNA有24个，sRNA有10个。对基因的功能进行注释，同时将该菌株与其公布基因组序列的近缘菌株D.dadantii Ech586、D.dadantiiEch703、D.dadantii3937和D.zeae Ech1591进行了氨基酸共线性分析和核苷酸共线性分析，结果表明，D.zeae EC1与D.dadantii Ech586和D.zeae Ech1591具有最大的同源性，但同时包含一系列特异基因，其中包括Zeamine合成基因。