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本实验室筛选得到一株产唾液酸酶的原始菌乳酪短杆菌（Brevibacterium casei），它可把多唾液酸神经节苷脂（含有两个唾液酸的GD1a和GD1b，含有三个唾液酸的GT1b）去唾液酸生成单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)，而不作用于GM1。由于乳酪短杆菌产酶量低且遗传背景不清晰。不适合用于工业化生产GM1，因此有必要把唾液酸酶基因克隆出来并在大肠杆菌中异源表达。然后应用于转化多唾液酸神经节苷脂(GLS)反应中。 本课题首先根据唾液酸酶氨基酸保守序列设计兼并引物扩增出一段906 bp的保守序列，运用Tail-PCR扩增出该唾液酸酶基因全长为2922 bp，编码973个氨基酸。与质粒pET28a连接并在大肠杆菌BL21中实现可溶性活性表达，酶活为46800 U/ml，约为原始菌唾液酸酶的80倍。 然后，诱导后的重组大肠杆菌破壁离心后得到的上清运用硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水层析进行粗纯，结果用30％-50％硫酸铵分级沉淀的酶活回收率为68.8％，纯化倍数为4.68，纯度约为44.1％。而DEAE离子交换层析纯化效果不佳，疏水层析的酶活回收率为58.4％，纯化倍数为3.03，纯度约为38％。因此选择用30％-50％硫酸铵分级沉淀作为粗纯重组唾液酸酶方法，得到的粗酶可用于转化GLS。为了得到纯的重组唾液酸酶研究其酶学性质，在基因序列的N端和C端都加一个His标签，16℃低温诱导可用Ni-NTA亲和层析纯化得到纯度为85％的重组唾液酸酶，它的最适反应温度为37℃，最适反应pH为5.5，以4-MU-NeuAc为底物的Km值和Vmax值分别为0.08 mM和13.2μmol·min-1·mg protein-1。该重组唾液酸酶可以转化GLS生成GM1。 最后分别运用生长细胞、静息细胞和游离重组唾液酸酶转化GLS。其中生长细胞与静息细胞转化效果不好，虽然在静息细胞转化中添加0.5％的Tween-80可完全转化60 g/L神经节苷脂混合体中的GLS为GM1。但添加Tween-80增加下游GM1分离纯化的难度，且细胞转化体系复杂，因此不适合应用于转化GLS。而用游离重组唾液酸酶转化GLS不存在传质问题，反应速度快且体系简单利于下游GM1的分离纯化，因此选择用游离重组唾液酸酶转化GLS。 经研究发现游离唾液酸酶转化GLS反应中唾液酸抑制作用很严重，通过透析反应原位分离唾液酸可以解除唾液酸的抑制作用。125 g/L神经节苷脂混合体，100ml反应体系，10000 U/ml游离重组唾液酸酶，2L透析液，反应12h后神经节苷脂混合体中的GLS完全转化成GM1，GM1的含量从8％提高到36.56％。只要反应体系中的唾液酸浓度不超过抑制浓度，转化GLS反应就可以继续进行。