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研究背景最近几年来,高血压病导致心脑血管的常见合并症和并发症逐年攀升,给患者生存质量及预后带来严重的不良影响。高血压是一种长期、慢性迁延性疾病,持久的血压升高将损害血管内膜和平滑肌,使其舒缩功能下降,久而久之,心脏前后负荷增加,导致心肌损伤和血管重构及动脉硬化。高血压对心脏产生首当其冲的影响以左心室肥厚改变为著,心肌细胞病理性肥大是高血压导致的心脏主要病理改变。因此,如何进行有效的降压治疗对保护心血管系统具有重要的意义。作为血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors, ACEI)的依那普利降压效果明显,不仅可以有效舒张血管,而且可以拮抗对肾素-血管紧张素-醛固酮系统,可使肾脏血管壁和脑血管舒张,协同降低血压,并减轻心脏、肾脏、脑等重要靶器官的并发症。但是口服给药生物利用度低,如何改善药物的生物利用度是临床研究的热点之一,也将对药物效果产生积极的促进作用。为此,本研究尝试使用颊粘膜给药,以探讨以其为代表的非胃肠道粘膜给药的合理性。理论上,颊粘膜血管密集,血流丰富,药物吸收快,且避免了肝脏的首过效应;同时颊粘膜通透性较高,是体内通透性仅次于鼻粘膜和胃肠道粘膜的组织,而且酶含量较少,因此与其他粘膜给药方式相比,颊粘膜给药的方式可在短时间内达到一定的血药有效浓度,且波动较小,药效平稳而持久；此外,颊粘膜制剂服药方便,患者依从性也较强。为了探讨颊粘膜制剂的有效性,本研究选取一线抗高血压药物依那普利为基础来制备依那普利口颊粘膜给药系统,并探讨其生物利用度,临床疗效、以及患者的治疗依从性。在体内实验方面,本研究采用自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)作为动物模型,分别采用普通依那普利剂型和口颊粘膜剂型给药治疗,从血压、心功能方面、逆转左室重塑、心脏ACE和ACE2mRNA及蛋白质、醛固酮、血管紧张素、一氧化氮、内皮素表达等方法进行观察,并进行统计学分析,然后初步探讨其相关机制,为治疗高血压提供新药物剂型,在提高治疗效果的同时降低靶器官的损害,为临床治疗提供新的思路。目的1.为了提高疗效和患者依从性,制备新型依那普利的口颊粘膜给药系统,对比其与普通依那普利剂型的生物效应,以求克服生物利用度低的问题。2.观察普通依那普利剂型和口颊粘膜剂型对SHR的血压、心功能、左室重构的影响,并探讨其相关作用机制。3.观察依那普利口颊粘膜给药系统对SHR心脏ACE和ACE2表达的影响,以及血清醛固酮、血管紧张素Ⅱ、一氧化氮和内皮素表达的影响。方法1.依那普利口颊粘膜的制备使用粘膜粘附性多聚物、通过溶剂涂布技术,将依那普利的口颊粘膜给药系统配制成口腔贴膜的形式。2.检测SHR血压、心肌重塑及组织学分析1.实验分组：取30只SD大鼠,制备成自发性高血压模型,编号1-30。1)WKY对照组：取10只WKY大鼠,给予5ml/kg生理盐水灌胃,qd；2)SHR对照组：取10只SHR大鼠,5ml/kg生理盐水灌胃；3)普通依那普利剂型组：取10只SHR大鼠,给予依那普利lmg/kg,溶于5ml/kg双蒸水中,灌胃,qd；4)口颊粘膜剂型组：取10只SHR大鼠,给予依那普利口颊粘膜剂1mg/kg,口服,qd；疗程均为14天。2.血压的测量：检测尾动脉血压,记录相应的AMP、LVEDP、LVSP、+dp/dtmax及-dp/dtmax数据,3.心室重塑及心肌组织学分析：取心脏组织并检测左心室重量和心肌组织内胶原含量,采用光学显微镜和电子显微镜观察心肌细胞病理和超微结构变化；3.ACE及ACE2 mRM及蛋白的表达1.实验分组：同第二部分。2.心肌组织ACE及ACE2 mRNA的表达：采用琼脂糖凝胶电泳法测定。3.心肌组织ACE及ACE2蛋白的表达：取心肌组织标本,采用免疫组织化学染色法检测,以及Western Blot法检测。4.检测血清醛固酮、血管紧张素II、内皮素及一氧化氮1.实验分组：同第二部分。2.血清醛固酮、血管紧张素II和内皮素表达：采用放射免疫方法检测。3.血清NO表达：采用硝酸还原酶法检测。结果1.贴膜配方F2和F4具备良好的药代动力学特性所有配方均显示有高的药物百分含量(96.45%至98.49%)。有良好膨胀特性的配方显示有良好的驻留时间。在体外,发现包括贴膜(F2)在内的高粘性羧甲纤维素钠(SCMC-HV)的药物释放率最高(药物释放很快,在1.5小时内释放92.24%)、其次是贴膜F4(含有聚乙烯吡咯烷酮K-90 1% w/v个SCMC(HV) 1% w/v)。研究发现,在10小时结束时,F2和F4的活体外药物穿透率分别为82.24%和89.9%。配方F4具有快速释放、快速吸收和最长体外停留时间的特性。2.依那普利口颊粘膜制剂对心肌细胞结构,血压及心室重塑的影响1)心肌光镜下观察：WKY对照组：SHR对照组心肌细胞的损伤情况较WKY对照组更严重。SHR照组：光镜下可见大鼠心肌细胞的肌纤维失去正常排列,直径增粗,可见断裂现象出现,同时有间质水肿；少数心肌间质内可见胶原纤维沉着；小血管周围或附近的心肌细胞周围可见大量炎性细胞浸润,心肌细胞核萎缩,部分出现溶解、坏死。普通依那普利组：大鼠心肌病理改变明显较其他两个对照组改善。光镜下,普通组大鼠的心肌细胞肌纤维略增粗,排列较整齐,肌束间隙稍有扩大,肌纤维细胞核完整,多为一个,位于肌纤维中央;有部分炎性细胞浸润,少量细胞核膜不完整。口颊粘膜剂型组：口颊粘膜剂型组比普通依那普利组改变更轻微,基本趋于正常。2)心肌超微结构观察：WKY对照组：心肌肌原纤维排列整齐、致密、无断裂、线粒体体积大,数量多,嵴丰富排列紧密,肌浆网体积大、数量多,间质中有少量的胶原纤维附着,以细纤维居多。SHR照组：心肌细胞肿胀明显,心肌纤维排列紊乱,大量胶原纤维出现在细胞间质中,肌原纤维部分溶解,可见大小不等的液泡,以闰盘两侧为重。肌原纤维常见肌节错位和过度收缩,肌浆网略扩张,甚至扩张成大腔隙,肿胀断裂,数目减少,间质中粗大的和纤细的胶原纤维交织呈网状穿插。线粒体肿胀、嵴部分断裂溶解,模糊不清,形成线粒体内大小不等的空泡区,甚至溶解。明暗带不清,Z-线扭曲、变形,肌丝断裂、溶解,形成大量肌溶灶。普通依那普利剂型组：心肌细胞轻度肿胀,心肌纤维呈点阵状排列,较整齐密集,胶原纤维较多,分布在细胞间质中。心肌线粒体肿胀较多,并出现融合现象,排列较乱,嵴断裂。口颊粘膜剂型组：心肌纤维排列较整齐,细胞间质中胶原纤维较少,大部分细胞核完整、清晰,少数细胞核膜不完整。线粒体结构形态基本正常,呈椭圆形,线粒体嵴排列较规则,部分线粒体嵴有断裂及碎片形成。线粒体体积减小,数量接近正常。3)心肌细胞病理损伤方面：损伤程度从重到轻依次为SHR阴性对照组,WKY对照组,普通依那普利剂型组和口颊粘膜剂型组。光镜和电镜观察显示：心肌超微结构严重程度从重到轻依次为SHR对照组,WKY对照组,普通依那普利剂型组和口颊粘膜剂型组；与心肌细胞病理学结果一致,且两个治疗组细胞损伤均较对照组改善。4)血压指标方面：AMP、LVEDP、LVSP、+dp/dtmax及-dp/dtmax从重到轻依次为SHR阴性对照组,WKY对照组,普通依那普利剂型组和口颊粘膜剂型组；与心肌细胞病理学和显微镜观察结果一致,且两个治疗组细胞损伤均较对照组改善。5)心室重塑方面：心肌组织重量方面：各组LVM、LVMI差异无统计学意义(P>0.05)；胶原蛋白含量方面：从高到低依次为SHR对照组,WKY对照组,普通依那普利剂型组和口颊粘膜剂型组,而治疗后均较对照组更低,组间差异均有统计学意义(P<0.05)；3.依那普利口颊粘膜制剂对ACE及ACE2的影响1)心肌组织ACE及ACE2 mRNA的表达：ACE表达：表达程度从高到低依次为SHR阴性对照组,WKY对照组,普通依那普利剂型组和口腔粘膜剂型组；ACE2 mRNA表达：表达程度从低到高依次为SHR照组,WKY对照组,普通依那普利剂型组和口腔粘膜剂型组；且两个治疗组细胞损伤均较对照组改善。2)心肌组织ACE及ACE2蛋白的表达：ACE蛋白表达方面：表达程度从高到低依次为SHR阴性对照组,WKY对照组,普通依那普利剂型组和口腔粘膜剂型组；ACE2蛋白表达方面：表达程度从低到高依次为SHR照组,WKY对照组,普通依那普利剂型组和口腔粘膜剂型组；且两个治疗组细胞损伤均较对照组改善。4.依那普利口颊粘膜制剂对醛固酮、血管紧张素Ⅱ、ET、NO的影响1)醛固酮、血管紧张素II表达程度：从高到低依次为SHR阴性对照组,WKY对照组,普通依那普利剂型组和口颊粘膜剂型组。2)内皮素表达程度：从高到低依次为SHR阴性对照组,WKY对照组,普通依那普利剂型组和口颊粘膜剂型组。3)NO表达程度：从低到高依次为SHR阴性对照组,WKY对照组,普通依那普利剂型组和口颊粘膜剂型组；且两个治疗组细胞损伤均较对照组改善(P<0.05)。结论1.制备的依那普利口颊粘膜系统,配方F4具有快速释放、快速吸收和最长体外停留时间的特性。为后期进一步探索口颊粘膜药物研究提供了基础配方。2.与普通依那普利剂型相比,口颊粘膜制剂降压疗效明显,对左室重构具有明显的逆转作用。3.与普通依那普利剂型相比,口颊粘膜给药系统显著抑制SHR心脏ACE的表达,同时促进ACE2的表达。4.与普通依那普利剂型相比,口颊粘膜剂型给药显著下调SHR血清醛固酮、血管紧张素II、内皮素水平并上调一氧化氮的表达。