论文部分内容阅读
第一部分FOXC2在不同分子亚型的乳腺癌组织和不同侵袭潜能的乳腺癌细胞中的表达FOXC2是属于叉头框（Forkhead Box, FOX）家族蛋白成员之一，其功能涉及胚胎发育、细胞周期调控、糖类、脂类代谢等多种生物学过程。新近研究表明，FOXC2过表达与多种恶性肿瘤侵袭及转移密切相关。Mani等发现FOXC2过表达促进乳腺癌侵袭及转移，可作为基底型乳腺癌的一种重要分子标志物。Mego研究小组通过免疫磁珠方法从27例乳腺癌患者外周血中捕获一小部分循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells, CTCs），发现并确定多个EMT相关基因（Twist1, Snail1,Slug, ZEB, FOXC2）高表达，在21%患者至少有一个存在过度表达，而在三阴乳腺癌患者中，EMT相关转录因子过度表达更常见，提示新辅助化疗并不能消灭EMT化的CTCs。同样，FOXC2表达也受多个EMT相关因子（Snail1, Twist,TGF-β）调控，FOXC2在犬肾细胞（MDCK）中高表达可上调多种间质样标志物（Vimentin, Fibronectin, N-cadherin）表达，并下调多种上皮样标志物（E-cadherin,ZO-1）表达或使其表达易位。因此，转录因子FOXC2是否具有与已鉴定EMT转录因子相似作用，是否作为一种新EMT转录调控因子参与乳腺癌侵袭转移，有待进一步实验明确。目的：探讨不同分子亚型的乳腺癌组织和不同侵袭潜能的乳腺癌细胞系中FOXC2mRNA及蛋白表达差异，并重点探讨基底型乳腺癌中FOXC2与干细胞相关标志物CD44及CD133蛋白表达关系；以期明确FOXC2表达与乳腺癌侵袭表型及“干性”特征相关性，为阐明乳腺癌侵袭转移机制提供新的线索。方法：以人原发性乳腺癌组织标本为研究对象，采用免疫组化单染检测不同分子亚型的乳腺组织FOXC2蛋白表达情况，分析FOXC2表达差异与临床预后因素相关性；采用免疫组化双染检测基底型乳腺癌组织FOXC2与CD44或CD133蛋白共表达情况。选取高侵袭潜能的乳腺癌细胞系MDA-MB-231及MDA-MB-435作为研究对象，并有低侵袭潜能的乳腺癌MCF-7细胞及乳腺上皮细胞MCF-10A细胞作为对照；采用免疫荧光，RT-PCR及Western blot分别检测四种不同侵袭潜能的乳腺细胞系中FOXC2mRNA及蛋白表达情况。结果：（1）FOXC2蛋白在乳腺癌组织中呈高表达，多表达于基底型乳腺癌细胞核和或细胞浆，FOXC2蛋白表达与乳腺癌患者激素受体表达阴性、高组织学评分、高TNM分期、淋巴结转移阳性及肿瘤大小呈显著正相关，而与患者年龄、月经情况及病理类型无相关性；（2）结合免疫组化双染及相关分析结果提示FOXC2蛋白表达与CD44或CD133蛋白表达呈显著正相关。（3）FOXC2蛋白在乳腺癌MDA-MB-231及MDA-MB-435细胞呈高表达，阳性主要定位于细胞核和或细胞浆；（4）无论在基因抑或蛋白水平，FOXC2在乳腺癌MDA-MB-231及MDA-MB-435细胞中表达明显高于MCF-7及MCF-10A细胞。结论：FOXC2在基底型乳腺癌组织及高侵袭潜能的乳腺癌细胞系中呈高表达，提示其表达与乳腺癌侵袭表型相关；FOXC2介导乳腺癌恶性进展可能与癌细胞侵袭性及“干性”增强有关；FOXC2可能作为一种新的EMT转录因子参与乳腺癌侵袭及转移过程。第二部分上调FOXC2表达对低侵袭潜能的乳腺癌MCF-7细胞侵袭及迁移能力的影响及机制通过检测不同分子亚型的乳腺癌组织和不同侵袭潜能的乳腺癌细胞系中FOXC2mRNA及蛋白表达差异，我们发现FOXC2在基底型乳腺癌中呈高表达，提示其表达与乳腺癌侵袭表型相关；有研究表明乳腺癌上皮细胞在经历EMT后可以获得分子表型异质性。因此，探讨FOXC2是否通过EMT途径参与乳腺癌恶性表型调控，对阐明其在乳腺癌侵袭及转移机制具有重要意义。目的：探讨上调FOXC2表达对低侵袭潜能的乳腺癌MCF-7细胞侵袭及迁移能力的影响及机制，以期明确FOXC2是否通过调控EMT途径参与乳腺癌侵袭及转移。方法：构建FOXC2基因过表达慢病毒载体，获得稳定转染的MCF-7细胞株；倒置相差显微镜下观察转染前后MCF-7细胞形态学变化；采用免疫荧光，RT-PCR和Western blot方法分别检测转染前后MCF-7细胞EMT相关标志物mRNA及蛋白表达情况；采用Transwell小室模型检测FOXC2过表达对MCF-7细胞侵袭及迁移能力的影响；划痕实验检测FOXC2过表达对MCF-7细胞运动能力的影响。结果：成功构建人FOXC2基因过表达慢病毒载体，并获得稳定转染的MCF-7细胞株；相差显微镜观察显示FOXC2过表达诱导MCF-7细胞由上皮样表型向间质样表型转换；免疫荧光显示FOXC2过表达增强间质样标志物Vimentin蛋白表达和降低上皮样标志物E-cadherin及Claudin-1蛋白表达；Transwell小室模型检测显示FOXC2过表达明显增强MCF-7细胞侵袭及迁移能力；划痕实验显示FOXC2过表达显著增强其运动能力；RT-PCR和Western blot法分别基因和蛋白水平上阐明FOXC2过表达增强间质样标志物N-cadherin、Vimentin及Fibronectin-1蛋白表达，降低上皮样标志物E-cadherin及Claudin-1蛋白表达。结论:成功构建人FOXC2基因过表达慢病毒载体，并获得稳定转染MCF-7细胞株，为FOXC2功能奠定基础；FOXC2过表达增强乳腺癌MCF-7细胞侵袭及迁移能力，其机制可能是通过调控EMT途径参与乳腺癌恶性进展。第三部分上调FOXC2表达对“BCSCs微球体”富集的影响及机制越来越多研究表明，EMT不仅促进恶性肿瘤侵袭、转移及放化疗抵抗，同时也有利于CSCs的富集。前面研究已证实FOXC2介导EMT途径增强MCF-7细胞侵袭及迁移能力。由此可推测：FOXC2是否通过介导EMT途径参与BCSCs的富集及“干性”维持的调控。因此，探讨上调FOXC2表达对“BCSCs微球体”细胞富集及“干性”维持的影响及机制，对阐明BCSCs在乳腺癌复发及侵袭转移机制具有重要意义。目的：探讨上调FOXC2表达对乳腺癌MCF-7细胞来源的“BCSCs微球体”细胞富集及自我更新能力和多向分化潜能的影响，以期阐明FOXC2在“BCSCs微球体”细胞富集及“干性”维持中的作用及机制。方法：采用无血清悬浮培养方法培养“BCSCs微球体”，倒置相差显微镜观察转染前后“BCSCs微球体”形态学变化；免疫荧光检测转染前后“BCSCs微球体”细胞干细胞相关标志物表达；采用有限稀释及血清诱导分化方法分别检测转染前后“BCSCs微球体”细胞自我更新能力和多向分化潜能；流式细胞术检测转染前后“BCSCs微球体”细胞中CD44+/CD24-表型BCSCs亚群比例及细胞周期分布；RT-PCR和Western blot法分别检测转染前后干细胞相关标志物mRNA及蛋白表达情况。结果：通过无血清悬浮培养成功获得“BCSCs微球体”克隆球，且FOXC2过表达促进“BCSCs微球体”的富集，免疫荧光显示“BCSCs微球体”细胞高表达干细胞相关标志物CD44及CD133蛋白；血清诱导分化方法显示FOXC2过表达增强“BCSCs微球体”细胞自我更新能力和多向分化潜能；流式细胞术显示FOXC2过表达提高CD44+/CD24-/low表型BCSCs亚群及G0/G1期细胞比例；RT-PCR和Western blot结果显示FOXC2过表达促进“BCSCs微球体”细胞干细胞相关标志物CD44、CD133及OCT-4蛋白表达。结论：无血清悬浮培养可作为分选BCSCs的一种可靠方法；上调FOXC2表达促进“BCSCs微球体”的富集，增强“BCSCs微球体”细胞自我更新能力及多向分化潜能；FOXC2介导EMT通过上调干细胞相关标志物表达参与BCSCs富集及“干性”的维持。第四部分上调FOXC2表达对“BCSCs微球体”细胞裸鼠致瘤性及侵袭性的影响及机制前三部分研究已明确FOXC2调控EMT不仅增强乳腺癌MCF-7细胞体外侵袭及迁移能力，同时在促进“BCSCs微球体”富集及“干性”特征维持方面也发挥重要作用。为此，本部分拟在体内移植瘤模型上阐明FOXC2介导EMT对“BCSCs微球体”细胞裸鼠致瘤性及侵袭性的影响及机制。目的：探讨上调FOXC2表达对“BCSCs微球体”细胞裸鼠成瘤时间、肿瘤生长速度、EMT及干细胞相关标志物表达的影响，以期阐明FOXC2调控EMT在BCSCs移植瘤致瘤性及侵袭性作用和机制。方法：以转染空载体或FOXC2基因的MCF-7细胞来源的“BCSCs微球体”细胞为研究对象，建立裸鼠移植瘤模型，观察成瘤时间及肿瘤生长速度，绘制生长曲线；HE染色及荧光显微镜观察鉴定移植瘤组织病理情况；采用免疫荧光及Western blot方法分别检测移植瘤组织EMT相关标志物及干细胞标志物表达。结果：FOXC2过表达促进“BCSCs微球体”细胞移植瘤成瘤时间及生长；HE染色显示FOXC2过表达组瘤体内出现明显缺血坏死；免疫荧光显示FOXC2过表达增强移植瘤组织间质样标志物N-cadherin蛋白表达和干细胞相关标志物CD44及CD133蛋白表达，降低上皮样标志物E-cadherin蛋白表达；RT-PCR和Western blot法分别基因和蛋白水平上阐明FOXC2过表达增强间质样标志物N-cadherin、Vimentin及Fibronectin-1蛋白表达和干细胞相关标志物CD44、CD133、OCT-4及KLF-4蛋白表达，降低上皮样标志物E-cadherin及Claudin-1蛋白表达；结论：FOXC2介导EMT通过上调干细胞相关标志物表达，从而增强BCSCs裸鼠移植瘤的致瘤性及侵袭性。