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研究背景与目的地中海贫血(thalassemia,简称地贫)是由于珠蛋白基因表达比例失衡引起的一种遗传性血液病,表现为小细胞低色素性贫血。在我国主要发生在广西、广东、海南等省份。α-珠蛋白基因或者p-珠蛋白基因缺陷分别对应产生α-地贫或p-地贫,出生后血红蛋白主要成分为HbA,由两条α链和两条拾链组成,其中珠蛋白链由位于16p13.3的玖-珠蛋白基因簇和11p15.3的p-珠蛋白基因簇合成。据文献报道,大约90%的α地中海贫血是由包含α珠蛋白基因簇或其调控区域的片段缺失导致,大约95%的p地中海贫血是由p珠蛋白基因簇上的点突变引起。α-地中海贫血的表型因α珠蛋白基因缺陷的数目不同而表现出多样性。一个α基因缺失或突变为α+地中海贫血,两个α珠蛋白基因缺失或突变为值α0地中海贫血。一个或者两个α基因缺陷会导致轻度贫血症状。三个α基因缺陷时会引起HbH病,表现中度至重度贫血症状,四个α基因缺陷会导致围产期死亡,即Hb Bart’s水肿胎。对于一个α0地贫携带者和α+地贫携带者夫妇,其后代有25%的机会罹患HbH病。因此鉴定各种缺陷对于产前诊断是很有必要的。在α-地中海贫血中缺失突变属于常见类型,但α-珠蛋白基因簇重复容易被忽略,除非与p珠蛋白基因缺陷共遗传加重表型而被检测。过量的α-珠蛋白基因表达可能使p-珠蛋白基因缺陷的携带者表型从轻型加重成中间型。本研究鉴定了一个大片段重复突变家系和一个大片段缺失突变家系,两个大片段重排均从16号染色体短臂端粒起始,覆盖整个α基因簇。通过实时荧光定量PCR分析两个罕见突变中珠蛋白基因的mRNA表达水平。希望基于本次研究以筛查无法用常规方法鉴定的罕见地贫样本,并对研究基因组重组提供案例。材料与方法1.研究对象家系A：先证者是一个来自湖南邵阳的7岁小女孩,4岁时诊断为中间型p地贫,出现黄疸和肝肿大,血液学参数为：Hb54g/L、MCV68.4fL、MCH16.7pg、HbA26.8%和HbF6.3%,排除缺铁性贫血。先证者从出生11月时开始接受不规律输血,共四次。家系B：先证者是一个来自广西柳州的8岁小男孩,6月大时贫血面色苍白进行不规律输血,近一年来每月规律输血。先证者发育迟缓,肝脾肿大,严重贫血,在输血后一个月的血液学参数为：Hb45g/L、MCV73.5fL、MCH19.2pg、 HbA22.3%和HbF0.7%。2.实验方法采集先证者及其家庭成员的新鲜血样,进行血液学表型分析,结合表型分析结果进行α珠蛋白和β珠蛋白基因簇常见突变的检测。分析发现检测的已知突变不足以解释先证者表型,从而通过多重连接探针(MLPA)方法检测珠蛋白基因拷贝数变化。结果显示HBA基因探针检测位置全部缺失或重复,继而采取比较基因组杂交方法(aCGH)分析缺失或者重复断裂点区域。通过aCGH结果显示的断裂点范围,设计不同组特异性引物。将先证者基因组DNA片段化至2-3kb后,连接上通用片段后用通用引物扩增,完成建库。通过特异性引物与通用引物扩增建库后的样本,磁珠纯化后将扩增产物连接至T载,转化,挑取单克隆进行菌落PCR验证后送测序。通过该双重PCR、克隆、gap-PCR鉴定出大片段缺失或者重复的断裂点位置。通过实时荧光定量方法分析珠蛋白基因的mRNA表达水平,分析罕见突变杂合子对α-珠蛋白基因表达的影响。研究结果1.断裂点鉴定在家系A中,先证者7岁女孩输血一年后血红蛋白含量为61g/L,为小细胞低色素贫血,其中平均红细胞体积MCV为63.7fL、平均血红蛋白含量MCH为18.3pg,并且HbA2和HbF升高,分别为4.5%和7.7%。通过对β珠蛋白基因全长测序分析发现先证者携带有βCD41-42杂合突变,该杂合突变遗传自其母亲,α-珠蛋白基因全长突变未发现致病突变。多重连接探针技术分析α珠蛋白基因簇拷贝数,结果发现该先证者有大片段重复,重复范围超出探针指示范围,无法确定断裂点。全基因组比较基因组杂交技术显示,该先证者出现一个杂合的大片段重复,重复范围为从16号染色体短臂端粒起始至282kb(UCSC,hg19)。通过双PCR方法,显示从16号染色体短臂端粒起始至282199bp的大片段序列插入16号染色体短臂94054bp和94055bp之间,并在断裂点引入一个A碱基。结果分析显示,16号染色体94038bp-94053bp的序列和282184bp-282199bp的序列是一致的。对其他家系成员分析发现,该大片段重复突变遗传自其父亲。该大片段重复包括完整的α-珠蛋白基因簇,使α-珠蛋白基因数量从4个增加到6个,与βCD41-42共遗传解释了中间型β地贫的表型。在家系B中,8岁男孩先证者在输血一个月后血红蛋白含量为45g/L,平均红细胞体积MCV为73.5fL、平均血红蛋白含量MCH为19.2pg。通过对其α珠蛋白基因全长测序结果显示有αCSα/αα杂合突变,而β珠蛋白基因全长测序未发现致病突变,对其他家系成员分析显示该突变遗传自先证者的父亲。多重连接探针技术实验结果显示,先证者16号染色体α基因簇有大片段缺失,缺失范围超出探针检测范围,无法确定断裂点。全基因组的aCGH实验结果显示,大片段缺失从16号染色体短臂端粒位置起始至235kb位置。根据双PCR实验结果显示,断裂点位置为16号染色体短臂235259bp。通过其他家系成员分析,该大片段缺失遗传自其母亲。该大片段缺失包括完整的a-珠蛋白基因簇,使先证者原来的4个α珠蛋白基因减少为2个。大片段缺失与αcS突变双重杂合解释了先证者HbH的表型。2.基因型与表型分析在家系A中,大片段重复携带者Ⅰ1(基因型为αααα282/αα)显示正常的血红蛋白含量(Hb143g/L),和降低的平均红细胞体积(MCV77.4fL)、平均血红蛋白含量(MCH18.3pg)。该携带者HbF含量和HbA2结果显示正常(HbA22.6%,HbF0.6%)。先证者Ⅱ1共遗传αααα282和βCD41-42杂合突变,使其血红蛋白为61g/L,平均红细胞体积63.7tL,平均血红蛋白含量为18.3pg,胎儿血红蛋白及血红蛋白A2值上升,表现为中间型p地中海贫血。Ⅰ2结果显示为βCD41-42/β杂合子,其表型符合基因型。在家系B中,Ⅰ1检测出缺铁性贫血,其血红蛋白含量为103g/L, RDW-CV升高为17.9%。检测结果显示家系中其他成员排除缺铁性贫血。经过DNA分析,先证者Ⅲ1和家系成员Ⅱ3为大片段缺失和αCS的双重杂合子,基因型为--235/acSα,两者表现出严重的HbH贫血症状,血液学指标分别为：Ⅲ1,Hb45g/L, MCV73.5fL, MCH19.2pg, HbA22.3%, HbF0.7%;113, Hb66g/L, MCV78.1fL, MCH18.3pg, HbA22.3%, HbF0.7%.该家系中其他三个成员Ⅰ1,Ⅱ2和Ⅲ3基因型为--235突变携带者,有小细胞低色素表型,血红蛋白A2正常但接近临界值,表型与--SEA携带者相似。3. mRNA水平分析为了研究家系A中大片段重复和家系B中大片段缺失突变的功能影响,我们通过实时荧光定量PCR方法分析α和β珠蛋白基因mRNA比例,β-actin作为内参,正常人α/β mRNA比值定义为1。分析结果显示,在家系A中,先证者Ⅱ1(αααα282/αα, pCD41-42/βN)比值为4.913,大片段重复突变的杂合子Ⅰ1(αααα282/αα, βN/βN)比值为2.672,Ⅰ2(αα/αα, pCD41-42/βN)为2.422。该结果显示16号染色体上大片段重复突变αααα282使α-珠蛋白基因簇增加,导致α-珠蛋白基因mRNA表达水平增加。在家系B中,双重杂合子Ⅲ1和Ⅱ3(--235/αCsα)比例分别为0.161和0.179。大片段缺失的携带者Ⅰ1,Ⅱ2和Ⅲ3(--235/αα)比值为0.586,0.524和0.663。一个与家系无亲缘关系的--SEA/αα杂合子对照的α/β mRNA比值为0.527。该结果显示16号染色体上大片段缺失--235/αα使α珠蛋白基因簇缺失,导致α珠蛋白基因mRNA表达量降低,并且该缺失与--SEA/αα的mRNA表达量接近。结论本研究通过aCGH和双PCR方法鉴定了从16号染色体短臂端粒起始的一个大片段重复和一个大片段缺失突变,并确定了其断裂点。从表型和基因型分析两种罕见重排突变,为通过常规检测未找到突变的地中海贫血样本提供检测方法,同时也为研究基因组重排提供了研究样例。