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肝纤维化是诸如病毒性肝炎,血吸虫病,乙醇性肝炎等慢性肝病发展到肝硬化的必经阶段。这一过程中胞外基质合成与降解之间的平衡被打破,以胶原为主的胞外基质大量沉积,导致基底变硬,改变了细胞所处的微环境,使细胞或组织功能发生病变。然而纤维化过程是可逆的,因此学者们十分重视肝纤维化发展进程的研究。肝星状细胞(hepaticstellatecells,HSCs)是纤维化中最主要的胞外基质分泌细胞,它的激活在纤维化中扮演着非常重要的角色。因此,关于HSCs活化、增殖及其调控机制受到学者的大量关注。 组织纤维化是机体“愈伤反应”的一种表现形式,组织损伤归根结底是细胞损伤,细胞的损伤会造成两种病变现象:一是组织功能缺失;二是细胞死亡后形成的间隙,导致组织空间构象的改变。细胞死亡后形成的间隙,从力学角度来说即细胞间预应力遭到破坏,细胞会对这一信号做出响应。组织损伤后,细胞会受到多种自分泌或旁分泌因子的刺激。那么在机械损伤和细胞因子的双重影响下,细胞的迁移行为、周期及具有表征性的mRNA表达将发生怎样的变化呢?本实验以机械刻画的方法模拟体内细胞损伤造成的间隙,用促炎症反应因子IL-1及炎症抑制因子IFN-gamma刺激损伤后的细胞,利用细胞分子生物学、免疫组织化学、计算机图像处理及相应的统计软件等多种研究方法,观察其对HSCs的生物学活性的影响,本文的主要研究工作及得出的结论如下: 1)结合参考文献及根据实际情况做一些调整后,采用原位灌流,原位消化,Optiprep密度梯度分步离心的方法获得原代肝星状细胞,免疫荧光检测细胞α-SMA的表达; 2)通过多道划痕的方法制造机械损伤,损伤后0-12hHSCs迁移能力远高于12-24h及24-36h,说明损伤后12h内细胞生命活动旺盛,修复能力比较强。损伤后6hHSCsS期比率明显上升,同时TGF-beta1及Ⅰ型胶原mRNA表达量增加,表明机械损伤对HSCs的激活和胞外基质的表达构成影响; 3)IL-1、IFN-gamma作用于刻画后的细胞36h,会影响HSCs的迁移能力,前者可以增强其迁移活性,而后者则降低其迁移能力。且随着细胞因子浓度的增加,其对迁移能力的影响也变大。只有最高浓度和最低浓度之间存在显著性差异; 4)利用流式细胞仪检测IL-1及IFN-gamma对刻画后HSC-T6细胞周期的影响。IL-1、IFN-gamma分别作用于体外刻画后的HSC24h,IL-1可以增加细胞周期中S期的比率,而IFN-gamma可降低细胞S期比率,且都随浓度的增加,S期比率变化越大。表明其对HSCs的影响在于调节HSCs进入DNA合成期; 5)裂解细胞提取总RNA,然后用RT-PCR法,半定量检测细胞因子作用24h后对HSCsⅠ型胶原及TGF-beta1mRNA表达量的影响。实验结果显示,IL-1作用于机械损伤后的HSCs,其上调Ⅰ型胶原及TGF-beta1mRNA表达的能力高于单一的机械损伤,但IFN-gamma明显抑制损伤后HSCsⅠ型胶原及TGF-beta1mRNA的表达。同时,随着IL-1浓度的增加,其对Ⅰ型胶原及TGF-beta1mRNA表达的影响增大,但不同浓度IFN-gamma间差异很小。 整合以上结论,我们认为机械损伤会促进HSCs发生迁移并增加HSCsⅠ型胶原及TGF-beta1mRNA的表达。IL-1作用于机械损伤后的HSCs,会进一步增强其迁移和上述细胞因子表达,而IFN-gamma则能够抑制机械损伤所造成的HSCs迁移激活和胞外基质表达的增加。