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青光眼(glaucoma)是一组以视神经受损和视功能损害为共同特征的不可逆致盲眼病。病理性眼压(Introcular Pressure, IOP)升高是青光眼视神经受损的最主要危险因素。研究表明小梁网是房水(Aqueous humor, AH)流出的最关键部位,小梁网细胞外基质堆积,吞噬功能受损、小梁网细胞骨架的重构导致小梁网细胞形态、韧性、强度、细胞间黏附性改变等,是房水阻力增加、病理性眼压升高的主要原因。内皮素-1(endothelin-1, ET-1)是一种小分子生物活性多肽,在调控血管舒缩、细胞增殖、分化等方面发挥重要作用。同时,ET-1还是一种强大的促纤维化因子,在肾、肺和心肌细胞外基质重构和纤维化方面扮演重要的角色,另外,ET-1通过活化Rho激酶导致血管内皮和肺上皮细胞等细胞骨架的重构。ET-1还是重要的促炎和促氧化应激因子,可以促进细胞分泌其他因子如ICAM-1,TNF-α,IL-1、IL-6等及过氧化物等,介导炎症和氧化应激反应。最近,研究表明原发开角型青光眼(primary open angle glaucoma, POAG)、正常眼压青光眼(NormalTension Glaucoma, NTG),色素剥脱综合症患者和青光眼动物模型房水中的ET-1水平比正常明显升高,认为ET-1与青光眼发病密切相关。ET-1作为促纤维化、促氧化应激和细胞骨架调节因子,在小梁网的细胞外基质合成、吞噬功能、细胞骨架重构方面的作用尚不清楚。本研究拟通过以下四部分的研究系统观察ET-1对小梁细胞功能的影响：1.ET-1对体外培养人小梁网细胞(human trabecular meshwork cells, HTMCs)的细胞外基质----纤维连接蛋白(fibronectin, FN)、Ⅳ型胶原(typeⅣcollagen, ColⅣ)表达的影响,及ET-1对灌注培养人眼前段小梁网组织中FN、ColⅣ表达及眼压的影响；2.观察CTGF在ET-1促HTMCs合成FN、ColⅣ中的作用；3.观察ET-1对HTMCs吞噬功能的影响；4.观察ET-1对HTMCs细胞骨架蛋白F-actin的表达及重构的影响。以期探明ET-1在调控小梁网房水流出的作用及其分子机制,为POAG降眼压治疗提供新的理论依据。第一部分：ET-1对小梁网FN和Ⅳ型胶原表达的作用研究目的：1.观察ET-1及ET受体(ETR)拮抗剂对体外培养人小梁细胞(HTMCs)中纤维连结蛋白(FN)和Ⅳ型胶原(ColⅣ)表达的影响。2.观察ET-1对灌注培养人眼前段小梁网组织中FN、ColⅣ表达及眼压的影响。方法：1.体外培养HTMCs,并用抗神经元特异性烯醇酶(neurone specific enolase, NSE)、纤维连结蛋白(fibronectin, FN)、层粘连蛋白(laminin, LN)、Ⅷ因子相关抗原(FactorⅧrelated antigen, FⅧRag)免疫组织化学染色鉴定HTMCs。2.ET-1及ETR拮抗剂对体外培养HTMCs中FN、ColⅣ表达的影响：取传3代HTMCs,①观察不同浓度ET-1对HTMCs中FN和ColⅣ表达的影响,实验分为4组：对照组(0 mol／L ET-1)；ET-1低剂量组(10-9 mol／L)；ET-1中剂量组(10-8mol／L)；ET-1高剂量组(10-7mol／L),各组细胞分别孵育72h后,Weston-blot检测FN、ColⅣ的表达；②观察ETR拮抗剂对HTMCs中FN,ColⅣ表达的影响,实验分为4组：对照组；ET-1组干预组(10-7mol／L ET-1)；ETAR拮抗剂干预组(10-7mol／L ET-1+10-7mol／L BQ123)：ETBR拮抗剂干预组(10-7 mol／L ET-1+10-7mol／LBQ788),各组细胞分别孵育72h后,免疫荧光染色、Weston-blot检测FN、ColⅣ的表达。3.ET-1对灌注培养人眼前段小梁网组织FN和ColⅣ表达及眼压的影响：①建立人眼前段灌注培养模型；②取人眼(n=3对)灌注培养24h,记录基线眼压,然后分为对照眼(左眼),ET-1干预眼(右眼)；对照眼给予DMEM灌注培养,ET-1干预眼给予10-7mol／L ET-1灌注培养,记录干预后不同时点(6h,12h,18h,24h,30h,36h,42h,48h,54h,60h,66h,72h)对照眼和干预眼眼压；72h后人眼前段行4%多聚甲醛固定,石蜡切片,免疫荧光检测人眼小梁网组织中FN、ColⅣ的表达。结果：1.体外培养HTMCs呈NSE、FN、LN阳性表达,FⅧRag阴性表达,体外培养成功。2.ET-1及ETR拮抗剂对体外培养HTMCs中FN和ColⅣ表达的作用：①10-9～10-7mol／LET-1干预后HTMCs中FN表达上调,呈剂量依赖性,差异有统计学意义(P<0.01)；10-8～10-7mol／L ET-1干预后HTMCs中ColⅣ表达明显上调,差异有统计学意义(P<0.01)；②给予ETAR拮抗剂BQ123后,与ET-1组相比,HTMCs中FN、ColⅣ的表达降低(P<0.05)；但给予ETBR拮抗剂BQ788后,HTMCs中FN、ColⅣ的表达无明显变化(P>0.05)。3.ET-1对灌注培养人眼前段小梁网组织中FN和ColⅣ表达及眼压的影响：①10-7mol／L ET-1干预灌注培养的人眼前段后,小梁网组织中FN和ColⅣ表达和分布明显增多。②正常人眼前段基线眼压波动在15～20mmHg左右,对照眼基线眼压分别为：15,18,20mmHg,ET-1干预眼基线眼压分别为16,19,19mmHg,给予ET-1干预后眼压升高,72h后眼压分别为24,26,27mmHg,明显高于对照眼眼压16,19,20mmHg。结论：1.ET-1能够促进体外培养HTMCs中FN、ColⅣ的表达,其作用是通过激动ETAR起作用的。2.ET-1能够促进体内灌注培养人眼前段小梁组织中FN、ColⅣ的表达,并导致灌注培养模型眼眼压增高。第二部分：CTGF在ET-1促小梁细胞FN和Ⅵ胶原表达中的作用研究目的：观察结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)在ET-1促HTMCs合成FN和ColⅣ中的作用方法：取传三代HTMCs①观察不同时间点ET-1对小梁细胞CTGF、FN和ColⅣmRNA的影响。实验分为4组：正常对照组、24h干预组,48h干预组,72h干预组,给予10-7molET-1干预HTMCs,于不同时间点收集细胞,用RT-PCR观察CTGF、FN和ColⅣmRNA的变化。②设计并合成4条CTGF反义寡核苷酸(CTGF-ASDON)序列,转染传三代培养人HTMCs,RT-PCR检测其干扰效率,选择效果最有效的CTGF-ASDON序列进行后续实验。③观察CTGF-ASDON在ET-1促HTMCs中FN和ColⅣ表达的影响：选择传三代培养HTMCs,随机分为5组,A：正常对照组(单纯DMEM)、B：ET-1干预组(DMEM+10-7mol ET-1)、C：单纯CTGF-ASDON组(DMEM+脂质体+100nmol／LCTGF-ASDON)、D组：脂质体对照组(DMEM+脂质体)、E组：CTGF-ASDON+ET-1组(DMEM+10-7molET-1+脂质体+100nmol／LCTGF-ASDON),转染24h后收集细胞,提取细胞总蛋白,Western-blot检测CTGF、FN和ColⅣ的表达。结果：①给予ET1后,HTMCs中CTGF、FN和ColⅣmRNA水平较对照组明显上调(P<0.01),CTGFmRNA水平在48h达到高峰,FN和ColⅣmRNA在72h达到高峰,(P<0.01)。②合成CTGF-ASDON序列转染HTMCs后,CTGF-ASDON1干扰效率最佳,能下调CTGFmRNA水平达40%。③CTGF-ASDON+ET-1组与ET-1组相比,HTMCs中FN和ColⅣ表达明显降低(P<0.05)结论：下调CTGF后可减少ET-1促进HTMCs中FN、ColⅣ的表达,CTGF是ET-1促HTMCs合成FN和ColⅣ的重要的下游信号分子。第三部分ET-1对体外培养人小梁细胞吞噬功能的作用研究目的：观察ET-1及ETR拮抗剂对体外培养HTMCs吞噬功能的影响。方法：取传3代培养的HTMCs,①观察HTMCs吞噬动力学：HTMCs与直径0.5μm荧光标记的乳胶微粒共孵育0、4、8、12、24、48、72h,荧光显微镜下动态定量观察吞噬乳胶颗粒数。②观察不同浓度ET-1对HTMCs吞噬功能的影响：实验分为四组,对照组；ET-1低剂量组(10-9mol／L)；ET-1中剂量组(10-8 mol／L)；ET-1高剂量组(10-7mol／L),·与0.5μm乳胶颗粒共孵育24h后观察各组HTMCs吞噬乳胶颗粒数。③观察ETR拮抗剂对吞噬功能的影响：实验分为4组,对照组；ET-1组；ETAR拮抗剂组(ET-1+10-7mol／L BQ123)；ETBR拮抗剂组(ET-1+10-7mol／L BQ788),其中ET-1的浓度为10-8 mol／L,并与0.5μm乳胶颗粒共孵育24h,观察各组HTMCs吞噬乳胶颗粒数。结果：①HTMCs吞噬动力学示：HTMCs与乳胶颗粒共孵育4h时细胞后可见明显的吞噬颗粒,随时间延长吞噬微粒数明显增多,24h吞噬微粒密度最佳,48h吞噬微粒达到饱和,细胞形态改变；24h是实验观察的最佳时点。②加入10-9～10-7mol／LET-1干预后,HTMCs吞噬乳胶微球数明显减少,呈浓度依赖性(P<0.05)；③给予ETR拮抗剂干预后：ETAR拮抗剂组吞噬颗粒较ET-1组明显增多(P<0.05),而ETBR拮抗剂组与ET-1组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论：ET-1能抑制体外培养的HTMCs吞噬能力；ET-1主要通过ETAR来发挥其抑制吞噬作用。第四部分ET-1对体外培养人小梁细胞骨架蛋白F-actin的作用研究目的：观察ET-1对HTMCs细胞骨架蛋白F-actin表达的影响。方法：取培养3代HTMCs,随机分为四组：对照组(0 mol／L ET-1)；ET-1低剂量组(10-9mol／L)；ET-1中剂量组(10-8mol／L)；ET-1高剂量组(10-7mol／L),ET-1处理72h后,收集细胞,提取细胞总蛋白,应用Western-blot方法检测HTMCs中骨架蛋白F-actin的表达,并用FITC-phalloidin荧光探针观察F-actin在HTMCs内的分布。结果：①ET-1作用后HTMCs中F-actin表达明显增高,在10-9～10-7mol／L浓度范围内呈剂量依耐性(P<0.05)；②荧光探针示ET-1组HTMCs中F-actin应力纤维和周边肌动蛋白明显增多、浓集,分布紊乱,细胞边缘僵硬锐利；细胞-细胞、细胞-细胞外基质间黏结明显增多。结论：ET-1促进HTMCs中F-actin的表达增多、细胞黏结形成,导致细胞骨架重构。研究总结一、主要研究结果1.本研究证实：ET-1能够通过ETA受体促进体外培养HTMCs中FN及ColⅣ的表达；进一步发现ET-1能够促进灌注培养人眼前段小梁组织中FN及ColⅣ的表达,并导致灌注培养人眼前段的眼压升高。推测ET-1可能在POAG患者小梁细胞外基质堆积和房水流出阻力中发挥重要作用。2.下调CTGF能明显抑制ET-1促HTMCs中FN、ColⅣ的表达,提示CTGF可能是ET-1介导FN、ColⅣ表达的重要下游信号分子。3. ET-1能够通过ETA受体抑制体外培养HTMCs的吞噬功能。4.本研究证实ET-1促进体外培养HTMCs细胞骨架蛋白F-actin的表达,导致细胞骨架重构；二、研究结论ET-1可能通过促进HTMCs细胞外基质(如FN、ColⅣ)表达、细胞骨架重构(如F-actin)和抑制吞噬功能等多方面影响小梁细胞功能,导致房水流出受阻,眼压升高。通过给予ETA受体抑制剂或下调CTGF的表达,可能有望改善小梁细胞整体功能。