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目的GP73作为新发现的在肝癌组织和血清中表达异常增加的高尔基体定位蛋白,其功能尚不明确,仅知道它与某些肿瘤如肝癌等密切相关,且推测其可能对肝癌细胞高尔基体结构和功能的维持具有重要作用,但仍需要进一步研究。因此,本实验拟从改变GP73表达对肝癌细胞增殖的影响的角度去研究GP73在肝癌中的生物学功能。方法1.采用Western-blotting方法检测GP73蛋白在各种细胞株中的表达水平,选定肝癌细胞株HepG2作为我们的研究载体细胞。2.我们设计GP73特异的siRNA,脂质体法转染肝癌细胞株HepG2,收集细胞总蛋白,Western-blotting去检测GP73蛋白表达水平的变化,确定干扰片段的干扰效果。3.使用GP73siRNA转染HepG2细胞,MTT法分别在转染后Oh、24h、48h和72h检测其细胞活力,观察细胞增殖速率的变化；转染后60h加Nocodazole阻滞12h,收集细胞,PI染色细胞核DNA,流式细胞仪检测其DNA含量,计算细胞周期各时相比例的变化；转染后72h,收集细胞,Annexin V/PI双标记染色,流式细胞仪检测两种染料的荧光强度,计算细胞凋亡的变化。通过以上实验初步观察GP73蛋白对肝癌细胞增殖的影响。4.进一步探索以上现象的分子机制。利用相关信号转导通路蛋白p-ERK、 p-JNK、p-c-jun、p-Rb、p-CDK4、p-CDK6、CDK4、CDK6、cyclin D3等的特异性抗体,Western-blotting去检测其蛋白的表达变化,深入研究GP73在肝癌细胞中发挥生物学功能的具体机制。结果1.本实验设计的GP73干扰片段siRNA对HepG2细胞中GP73蛋白的表达具有明显的抑制作用；2.降低HepG2细胞中GP73蛋白表达可导致细胞增殖抑制；3.降低HepG2细胞中GP73蛋白表达可导致细胞周期阻滞于G1期；4.降低HepG2细胞中GP73蛋白表达导致细胞增殖抑制和细胞周期阻滞分别是通过抑制CDK4、CDK6、cyclin D3的表达和JNK、ERK、CDK4磷酸化实现的。结论GP73蛋白分别通过调控JNK、ERK和Rb蛋白的磷酸化而影响细胞增殖和细胞周期。