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盐害引起植物细胞内离子毒害、渗透胁迫,破坏胞内离子平衡,进而引起一系列次级胁迫,并最终导致植株代谢失调,甚至死亡。磷脂酶D(phospholipase D,PLD)广泛存在于细菌和高等动、植物中,它能够水解磷脂,产生磷脂酸(phosphatidic acid,PA)和极性头部。研究表明PLD与PA在植物生长发育、响应环境刺激和激素信号等过程中起重要作用。NaCl可诱导绿藻、番茄、苜蓿和拟南芥等高等植物PLD基因表达和活性升高；而PLDαl是已检测的植物中普遍存在、丰度最高的PLD同工酶,但对于它调控植物适应盐胁迫机理方面的研究还很少。本研究以Columbia生态型拟南芥(野生型)、T-DNA插入敲除PLDαl突变体(pldαl)、RNA干扰MPK6突变体MPK6-RNAi为材料,主要研究了PLDαl、PA及MPK6在盐胁迫中的作用及相互关系。研究结果如下:
首先通过测定NaCl胁迫下野生型及pldαl突变体的种子萌发率、存活率、干物质积累量、根部生长量、叶片细胞膜透性等生长和生理指标,系统比较了野生型和pldαl突变体的耐盐能力。实验结果显示,在盐胁迫下野生型种子萌发率、幼苗生长量均显著高于pldαl突变体；而叶片细胞电导率则显著低于pldαl突变体。这些结果综合表明PLDαl缺失导致拟南芥耐盐能力降低,提示PLDαl在拟南芥对盐胁迫的适应过程中起正调节作用。
为进一步探讨PLDαl在植物适应盐胁迫中的作用,我们检测了盐胁迫下野生型及pldαl突变体体内PLDα活性的变化,发现,在100 mmol·L-1 NaCl处理30分钟后野生型幼苗叶片内PLDα活性显著升高,处理1小时后达到峰值,随后随处理时间延长下降到对照水平；而pldαl叶片中的PLDα基本无活性,与对照相比无显著变化。进一步实验发现100 mmol·L-1 NaCl处理30分钟后野生型体内PA含量升高,并达到pldαl突变体的2倍,之后随处理时间延长而下降,并与pldαl突变体无显著差异。同时还发现盐胁迫下野生型中水平显著升高的PA分别为含有34:2,34:3,34:6,36:3,36:6脂肪酸链的PA。加入PLD转磷酰基竞争性抑制剂正丁醇抑制PLD水解磷脂产生PA,加重了100 mmol·L-1 NaCl对野生型和pldαl突变体根伸长生长的抑制；而外源PA则减缓了100 mmol·L-1 NaCl对两种材料根部生长的抑制作用。实验结果综合表明PA能够在一定程度上缓解盐胁迫的伤害。因此我们认为,PLDαl通过PA介导拟南芥对盐胁迫的适应过程。随后还发现,在盐处理下,野生型叶片中质膜质子泵活性先升后降；但pldαl突变体叶片中质膜质子泵活性变化不大,并且在处理时间内,野生型叶片中质膜质子泵活性一直显著高于pldαl突变体。用PA体外处理从野生型叶片中提取的质膜膜微囊,发现100μmol·L-1 PA能够显著提高质膜质子泵活性。进一步观察到,盐胁迫下野生型幼苗根部Na+含量与pldαl突变体处于同一水平,无显著性差异,但其叶片中Na+含量则显著低于pldαl突变体。并且100 mmol·L-1 NaCl处理下两种材料叶片和根部K+含量均显著降低,材料间无显著差异。实验结果表明缺失PLDαl影响了拟南芥对Na+的吸收和转运。
MAPK(mitogen-activated protein kinase)的活化被认为可以增强植物对多种胁迫的耐受能力,目前在植物中已发现盐胁迫活化多种MAPK,因此人们认为MAPK的活化是植物适应盐害的一种基本的信号反应。我们发现,盐胁迫诱导野生型和pldαl突变体幼苗中以MBP为底物的激酶总活性升高,暗示以MBP为底物的激酶参与了拟南芥对盐胁迫的适应过程；并且野生型显著高于pldαl突变体,推测盐胁迫对以MBP为底物的激酶的激活在一定程度上依赖PLDαl。从拟南芥中克隆MPK6的cDNA,并且将MPK6 cDNA截断得到C-1(889～1188bp)、C-2(589～1188bp)、C-3(229～1188bp)cDNA片段,随后将它们分别连接至带有His标签的表达载体pET-28a(+)当中,在大肠杆菌中诱导重组蛋白表达,得到相应的MPK6全长蛋白和C-1(296～396aa)、C-2(196～396aa)、C-3(76～396aa)蛋白片段。利用脂印迹方法检测到PA能够特异性结合MPK6,并且能与MPK6被截断后残余的C末端结合,推测MPK6的C末端中存在着导致其与PA结合的结合位点。Hogl(high osmolarity glycerol)能磷酸化Nhal(Na+/H+逆向转运体)和TOK1(K+离子通道到)等与盐胁迫相关的蛋白,促使酵母适应盐胁迫,通过比对发现MPK6与Hogl39％同源、66％相似,并且酵母功能互补实验结果显示MPK6的表达在一定程度上提高了hogl突变菌株的耐盐性,部分补偿了突变体中缺失hogl的影响。进一步分析比较MPK6-RNAi突变体与野生型拟南芥的耐盐能力,发现前者耐盐能力弱于后者,这些实验结果表明MPK6是介导拟南芥适应盐胁迫过程的。外施PA能够提高盐胁迫下pldαl幼苗干物质积累量和根部生长量,减缓盐胁迫对pldαl突变体的伤害,但对MPK6-RNAi突变体影响不大,说明拟南芥中MPK6蛋白表达被阻断的影响,不能通过外源PA而消除。
通过分析比较野生型与pldαl突变体的耐旱性,发现干旱胁迫下,与野生型相比,pldαl突变体叶片发黄、严重萎蔫,植株生长被严重抑制,叶片相对电导率显著增高,叶片相对含水量则显著降低；在干旱胁迫早期,气孔开度则显著高于野生型。根据实验结果推测PLDαl及PA通过调控气孔运动,控制水分散失,介导拟南芥对干旱胁迫的响应。
另外我们观察了ABA对野生型、pldαl突变体种子萌发的影响,发现ABA处理下二者种子萌发率相差不大,但野生型胚轴明显比pldαl突变体短、细,推测PLDαl及PA转导ABA信号,介导了ABA对种子萌发的抑制过程。随后分别以150 mmol·L-1甘露醇、75 mmol·L-1 NaCl进行干旱和盐处理,发现野生型与pldαl突变体内源ABA水平无显著差异,推测缺失PLDαl并不影响干旱和盐胁迫诱导ABA含量升高。
上述研究表明,PLDαl及PA介导了拟南芥对盐和干旱胁迫的响应过程。在盐胁迫下PLDαl活性及PA水平升高,一方面激活质膜质子泵,为质膜Na+经Na+/H+逆向转运排出胞外提供驱动力；另一方面结合MPK6,通过它转导盐信号。此外,结合本实验室其他研究者前期研究结果,在渗透胁迫下PLDαl和PA调控气孔开度,减少水分蒸腾。推测PLDαl和PA可能通过调控气孔开度,减少水分蒸腾,减少随蒸腾作用向叶片运输的Na+,提高植物耐盐能力。PLDαl及PA转导ABA信号,介导了ABA对种子萌发的抑制过程,但不影响干旱和NaCl诱导ABA含量升高。