论文部分内容阅读
活性维生素D维持人体正常代谢所必须的物质,在治疗佝偻病,骨质疏松症,以及免疫疾病,内分泌疾病方面具有很大药用价值。目前国内外对维生素D的转化研究大多采用微生物转化法。研究报道假诺卡氏菌属自养菌株,链霉菌属等放线菌以及其他微生物都能对VD特异性羟基取代生成具有生物活性VD,但国外对其转化机理研究较少,尤其对假诺卡氏菌的转化机理研究就更加少,国内在假诺卡氏菌对维生素D的转化机理几乎属于空白。为了填补国内假诺卡氏菌对维生素D转化机理的研究上的空白,本论文研究了本组所筛选得到的CGMCC 5098菌对维生素D类的活性转化并且研究其转化机理。首先,采取本课题组筛选的CGMCC 5098菌株对维生素D3,D2,以及10-酮-6-甲氧基-3,5-环维生素D2,1a-羟基-19-nor-维生素D2进行转化,并对转化产物进行TLC,核磁共振和质谱的分析,鉴定转化产物中都有25-羟基取代产物,表明CGMCC 5098菌株都能对四种维生素D底物进行25-羟基化取代。为了确定CGMCC 5098菌株的种属关系,本论文对该菌株进行形态和分子生物学鉴定。通过显微观察以及16s rDNA扩增测序确定CGMCC 5098菌株为自养假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica。根据NCBI数据库中已报道类似功能基因分析,找出维生素D羟基化酶基因的高保守区,并对其进行分析,确定氧结合位点和血红素结合位点两个保守区,设计兼并性引物,扩增高保守片段,并测序分析。本论文为了研究该菌对维生素D的转化机理,采用4种方法包括LA PCR,反向测序法等克隆CGMCC 5098菌株基因组维生素D羟基化酶基因,但未能扩增全长。构建一种改进的CTAB法快速提取革兰氏阳性假诺卡氏菌基因组DNA以满足de novo高通量测序要求并且适用于其他各种生物分子学操作。最后,本课题组与千年基因生物公司合作完成对CGMCC 5098菌进行de novo全基因组测序。本次研究对该菌基因组和羟基化酶基因分析,筛选得到维生素D羟基化酶功能基因,采用生物信息学分析方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的生物学特性。