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碱性纤维素酶是在碱性条件下可发挥催化作用的β—1，4—葡聚糖内切酶，可广泛应用于洗涤剂，生物化工等方面。但由于碱性纤维素酶的酶活力普遍较低，其应用受到了很大的限制。本课题通过筛选得到了高活力的碱性纤维素酶产生菌；克隆了其β—1，4—葡聚糖内切酶基因并在大肠杆菌中进行了高效的表达；应用定向进化技术对β—1，4—葡聚糖内切酶的催化效率进行了定向进化研究，利用高通量的筛选方法，筛选到了催化效率提高的突变酶。本课题的主要研究结果如下：
(1)利用水解圈和菌落直径比大小进行初筛和酶活力测定复筛相结合的方法从几十个土样中分离到了两株活力较高的碱性纤维素酶产生菌H9和H12，菌株H9摇瓶发酵产CMC的酶活力可以达到2.06U/mL。酶的最适合催化温度为55℃，最适合催化pH为8.0，对温度和pH具有良好的稳定性。
(2)通过形态、生理生化实验，16S rRNA基因序列等实验，鉴定两菌株为短小芽孢杆菌。基于GeneBank中与其16S rRNA基因序列同源性较高的模式菌株进行系统发育分析，结果表明两菌株均与短小芽孢杆菌的关系最近，进一步证明了两菌株为短小芽孢杆菌。
(3)利用PCR方法扩增出了两菌株的DNA序列条带，酶基因序列分析表明：两菌株的β—1，4—葡聚糖内切酶基因编码序列均由1980个碱基组成，酶分子由659个氨基酸组成，预计分子量为73KD左右。将该序列与GeneBank中已报道的氨基酸序列进行对比，结果表明与已报道的短小芽孢杆菌所S-27及枯草芽孢杆菌KSM—522所编码的葡聚糖内切酶具有较高的同源性，将两基因序列分别提交GeneBank，序列接受号分别为EF501975，EF620915。
(4)酶的结构域分析显示酶由两个不连续结构域组成的标准蛋白，其一为N—端催化结构域，由糖基水解酶家族9组成，该结构域主要起催化底物水解的作用；第二个结构域为C—端底物结合结构域，由碳水化合物绑定结构域家族3组成，两个结构域之间由一段连接序列连接。基于一级结构氨基酸顺序分析显示蛋白的N—端催化结构域主要由α螺旋结构组成，而C—端结合结构域主要由β折叠结构域组成。
(5)以重组载体pMD18—EglA为模扳，亚克隆得到EglA基因，基因片段用BamHI和XhoⅠ双酶切，构建到同样用Bam HI和XhoⅠ双酶切处理的表达载体pET20b中，获得重组表达载体pET20—EglA。将重组表达载体分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pET20b-EglA。将重组大肠杆菌接入三角摇瓶进行培养，当培养至对数期时加入诱导物IPTG，然后培养一定时间取样测定酶活力，其细胞外酶活力可以达到3.51U/mL。
(6)重组大肠杆菌菌株发酵液的SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳结果表明重组大肠杆菌菌株具有73KD左右的蛋白质分泌条带，分子量大小与理论值相一致。
(7)利用阳性转化子可以在LB-CMC平板上面可以产生透明圈的原理，为了减少工作量，根据转化子在LB-CMC平板上产生水解圈的大小进行初筛，对初筛菌株酶活力测定进行复筛，经过一轮易错PCR，从转化子中筛选到了一株酶活力提高的突变菌株，结果显示突变酶活力大约是重组酶活力的1.32倍，而突变酶的表达量比重组酶的提高了5％，这说明突变酶的催化效率确实得到了提高，突变酶的催化效率约为野生酶的1.26倍。基因测序结果表明有3个碱基发生了突变，突变导致酶的氨基酸序列中2个氨基酸发生了改变：其中野生酶突变位点的密码子AAA(106bp)位点突变为了GAA，其编码的氨基酸由赖氨酸变为了为谷氨酸；其中野生酶突变位点的密码子TTT(1760bp)突变为了密码子TCT，其编码的苯丙氨酸突变为了赖基酸，而1962bp处碱基突变造成密码子GGT变为了GGC，但是其编码的氨基酸没有发生改变，为同义突变。