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肝纤维化是机体对慢性肝损伤刺激的一种修复反应,以细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过度增生与异常沉积为特征,尤其以I型胶原沉积为主。它是肝硬化的早期阶段,在一定情况下可被逆转。但若病因持续存在,肝纤维化逐渐加重,肝脏的正常结构遭到破坏,假小叶形成即发展为肝硬化。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)活化、增殖进而合成大量ECM是各种肝脏损伤引起肝纤维化的中心环节。活化的HSC不但是胶原产生的主要细胞,也是调节ECM降解的因子基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和金属蛋白酶抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs)的主要来源。HSC活化后表达血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor, PDGFR)、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)、成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor, FGFR)、肝细胞生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor, HGFR)、神经细胞生长因子受体(nerve growth factor receptor, NGFR)等多种酪氨酸激酶受体,这些受体与相应的细胞因子结合,启动细胞内的信号转导系统,如Ras/Raf/丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)途径和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/Akt/核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(70-kDa ribosomal S6 kinase,p70S6K)信号途径,进而从增殖、凋亡、血管形成以及胶原代谢等多方面调节HSC的生物学活性。多激酶抑制剂是近年来新研发的一类多靶点药物,以PDGFR、VEGFR、干细胞因子受体(c-Kit)和Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)等为靶点,抑制Ras/Raf/MAPK和PI-3K/Akt/p70s6k信号通路的激活而发挥抑制细胞增殖和血管生成的双重作用。多激酶抑制剂许多作用靶点在纤维化时是上调的,为分子靶向治疗提供了理论基础。Yoshiji H等发现伊马替尼显著抑制肝纤维化进展,降低肝羟脯氨酸含量,体外实验发现伊马替尼抑制PDGF-BB诱导的HSC增殖、迁移,下调I型胶原α2和α-SMA mRNA表达。Sunitinib是另一个多靶点激酶抑制剂,动物试验发现sunitinib能够减少肝内血管形成、炎症细胞的浸润及肝星状细胞的激活,降低肝脏胶原的表达和门脉压力。Sorafenib为活性更强的多靶点酪氨酸激酶抑制剂,Mejias M等发现sorafenib能够降低肝硬化大鼠的门脉压力,减轻肝组织的损伤、炎症,抑制肝内新生血管的形成。尽管sorafenib在降低门脉高压中的作用得到揭示,但sorafenib对肝纤维化的作用目前仍未明,对HSC的活化、胶原代谢的影响及其机制知之甚少。本实验从体内和体外两个方面研究sorafenib对肝纤维化大鼠和HSC胶原代谢的影响,并初步探讨其对胶原代谢的影响机制。实验内容主要包括以下4部分。第一部分:Sorafenib对实验性大鼠肝纤维化的影响目的:研究sorafenib对肝纤维化大鼠肝组织病理、羟脯氨酸含量以及I型胶原表达的影响。方法:运用胆总管结扎(bile duct ligation, BDL)和二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine, DMN)腹腔注射的方法建立两种不同的肝纤维化动物模型。在造模的第三周和第四周给予sorafenib灌胃治疗,每天一次,共2周。肝组织切片经HE和Masson三色染色检测病理变化,比色法测定肝组织羟脯氨酸含量,Real time Q-PCR和Western blot方法检测I型胶原的表达。结果:①HE和Masson三色染色结果证明采用胆总管结扎和二甲基亚硝胺腹腔注射两种不同的方法成功建立了肝纤维化动物模型。②Sorafenib治疗后,BDL和DMN大鼠肝内纤维组织增生减轻,炎性细胞浸润减少。肝纤维化计分在BDL大鼠于20mg/kg和40mg/kg治疗组分别为11.92±1.35和8.64±2.13,与溶剂对照组(16.97±2.82)相比显著减低,P<0.01;而在DMN大鼠肝纤维化计分在1mg/kg和5mg/kg治疗组分别为12.41±3.34和9.65±3.02,明显低于溶剂对照组(17.17±3.65),P<0.01。③Sorafenib降低了肝组织中羟脯氨酸含量,BDL大鼠在20 mg/kg和40 mg/kg治疗组肝组织羟脯氨酸含量分别为(247.00±16.05)μg/g和(200.00±50.81)μg/g,低于溶剂对照组(442.50±139.14)μg/g,P<0.05;DMN大鼠在1 mg/kg和5 mg/kg治疗组肝组织羟脯氨酸含量分别为(340.00±19.87)μg/g和(214.40±35.71)μg/g ,在5 mg/kg治疗量组降低明显,P<0.05。④Sorafenib抑制BDL大鼠肝组织Ι型胶原蛋白及mRNA表达,应用Western blot方法发现sorafenib在20 mg/kg和40 mg/kg治疗后,Ι型胶原蛋白表达分别为0.54±0.02和0.51±0.01,表达下调了14.86%和17.89%,P<0.01;Real-time PCR方法发现Ι型胶原α1 mRNA相对表达量分别为1.77±0.33和1.56±0.18,基因表达下调46.69%和53.01%,P<0.01。⑤Sorafenib剂量依赖性地抑制DMN大鼠肝组织Ι型胶原蛋白及mRNA表达,sorafenib在1 mg/kg和5 mg/kg治疗后,Ι型胶原蛋白相对表达量下调了14.92%和32.18%,P<0.05;Real-time PCR方法发现Ι型胶原α1 mRNA相对表达量分别为1.29±0.92和1.14±0.15,mRNA表达下调43.17%和49.78%,P<0.01。而且40 mg/kg治疗组比20 mg/kg治疗组对Ι型胶原抑制效果明显。结论:胆总管结扎和腹腔注射二甲基亚硝胺诱导肝纤维化形成过程中,肝组织羟脯氨酸含量逐渐增高,I型胶原蛋白和mRNA表达提高;Sorafenib治疗后,肝内炎症和纤维组织增生减轻,纤维化计分和羟脯氨酸含量降低,I型胶原表达下调,肝纤维化程度减轻。表明sorafenib具有抗纤维化作用,提示可能是一种新型抗纤维化药物。第二部分:Sorafenib对实验性肝纤维化大鼠α-SMA、MMP-13和TIMP-1表达的影响目的:研究sorafenib对肝纤维化大鼠α-SMA、MMP-13和TIMP-1表达的影响。方法:运用胆总管结扎和二甲基亚硝胺腹腔注射的方法建立两种不同肝纤维化动物模型。采用不同剂量sorafenib (BDL: 20mg/kg和40 mg/kg; DMN: 1 mg/kg和5 mg/kg)治疗2周。免疫组织化学检测α-SMA、MMP-13和TIMP-1在肝组织的表达情况,Real time Q-PCR和Western blot方法检测MMP-13和TIMP-1的表达。结果:①随着肝纤维化的进展,α-SMA阳性着色细胞逐渐增多,阳性着色主要分布于汇管区、纤维间隔、肝窦周围及门静脉周围的间质细胞。Sorafenib明显抑制BDL和DMN大鼠肝组织α-SMA表达,sorafenib 20 mg/kg和40 mg/kg组BDL大鼠α-SMA阳性染色平均光密度分别为30.72±1.87%和18.05±4.02%,低于溶剂对照组38.19±2.10%,P<0.01;而DMN大鼠在sorafenib 1 mg/kg和5 mg/kg治疗2周后,α-SMA表达较溶剂对照组明显减弱(23.06±2.20%, 20.63±2.50% vs 32.32±4.40%),P<0.01。②肝纤维化过程中,TIMP-1表达增强,而MMP-13在肝纤维化早期表达增强,晚期减弱,存在MMP-13和TIMP-1比例失衡。③Sorafenib抑制肝纤维化大鼠TIMP-1蛋白及mRNA的表达,在BDL大鼠,sorafenib在20 mg/kg和40 mg/kg治疗组TIMP-1蛋白表达分别下调了31.69%和47.87%,mRNA表达下调44.63%和43.65%;而在DMN大鼠,sorafenib在1 mg/kg和5 mg/kg治疗量时TIMP-1蛋白表达分别下调44.14%和55.18%,mRNA表达分别下调72.03%和67.56%。④Sorafenib上调MMP-13表达。在BDL大鼠,sorafenib在20 mg/kg和40 mg/kg时MMP-13蛋白表达分别上调164.35%和175.52%,mRNA表达上调78.50%和56.07%;而在DMN大鼠,sorafenib在1 mg/kg和5 mg/kg治疗量时MMP-13蛋白表达分别上调119.74%和152.7%,mRNA表达分别上调33.87%和57.26%。MMP-13表达主要见于纤维间隔内及其周围以及汇管区的部分间质细胞胞浆中,其中部分肝细胞有强阳性表达。⑤Sorafenib上调MMP-13/TIMP-1比值。随着肝纤维化进展,MMP-13/TIMP-1比值逐渐下降,模型4wk组MMP-13/TIMP-1比值最低,在BDL大鼠为0.32±0.06,在DMN大鼠为0.51±0.07。给予sorafenib治疗后,无论是BDL大鼠还是DMN大鼠,MMP-13/TIMP-1比值提高,逆转了MMP-13/TIMP-1失衡。结论:sorafenib治疗可以降低实验性肝纤维化大鼠α-SMA表达,减少HSC激活;另一方面,Sorafenib可抑制TIMP-1表达,上调MMP-13表达,纠正MMP-13和TIMP-1比例失衡,促进基质降解,从而发挥抗纤维化作用。第三部分:Sorafenib对肝星状细胞胶原代谢的影响目的:研究sorafenib对PDGF刺激的HSC胶原合成、MMP-13(或MMP-1)和TIMP-1表达的影响,探讨sorafenib调节胶原代谢的机制。方法:原代HSC、大鼠和人肝星状细胞株HSC-T6和LX-2用于实验,应用体外HSC培养技术,采用3H-脯氨酸(3H-pro)掺入法测定HSC胶原合成。Western blot和Real-time PCR检测I型胶原、MMP-13和TIMP-1蛋白和mRNA水平。结果:①PDGF-BB刺激可使大鼠原代肝星状细胞、HSC-T6和LX-2Ⅰ型胶原α1 mRNA表达分别上调5.45倍、2.49倍和2.20倍,使HSC-T6和LX-2Ⅰ型胶原蛋白表达分别上调1.26倍和1.10倍。2.5μM、5.0μM和10.0μM sorafenib使原代HSCⅠ型胶原mRNA下调54.90%、64.88%和64.51%;使HSC-T6 mRNA下调62.64%、67.94%和82.52%,蛋白下调21.28%、28.72%和38.30%;使LX-2 mRNA下调58.66%、67.06%和81.64%,蛋白下调17.40%、18.84%和18.84%,低于PDGF组,P<0.05。免疫细胞化学也发现sorafenib能够抑制Ⅰ型胶原蛋白的表达。②无论是否有PDGF的刺激作用,在2.5~10.0μM范围内,sorafenib浓度越高,对HSC 3H-Pro掺入的抑制作用越强,P<0.01。10.0μM sorafenib在12 h、24 h和48 h 3H-Pro掺入抑制率在HSC-T6分别为14.51%、36.67%和63.44%,在LX-2 3H-Pro掺入抑制率分别为22.69%、37.52%和71.74%。Sorafenib抑制胶原合成具有时间和剂量依赖关系。③PDGF-BB刺激可使HSC-T6和LX-2细胞TIMP-1蛋白分别升高1.29倍和2.31倍,mRNA表达上调2.57倍和2.11倍,P<0.01;Sorafenib干预24 h后可使HSC-T6和LX-2细胞TIMP-1蛋白下降,对HSC-T6在10.0μM时抑制作用最明显,而对LX-2细胞在5.0μM作用最明显。Sorafenib以剂量依赖的方式下调了HSC-T6和LX-2细胞和原代HSC TIMP-1mRNA表达。④Sorafenib仅在5.0μM时使LX-2 MMP-1蛋白表达上调约167.39%,在2.5μM和5.0μM时使原代肝星状细胞MMP-13 mRNA表达上调,而对HSC-T6 MMP-13表达基本无明显影响。结论:sorafenib以剂量依赖方式对HSC胶原合成产生抑制作用,通过抑制HSC胶原合成,减少胶原的产生;另一方面通过从蛋白和mRNA水平抑制TIMP-1表达,减少对MMPs阻止,促进已合成的ECM降解以减少胶原的沉积。第四部分:Sorafenib对肝纤维化大鼠及肝星状细胞胶原代谢影响的信号转导机制目的:研究sorafenib对HSC及肝纤维化大鼠信号分子Akt及ERK表达的影响,进一步探讨sorafenib调控胶原代谢的信号转导机制。方法:实验包括大鼠和人肝星状细胞株HSC-T6和LX-2以及BDL和DMN两种肝纤维化动物模型。应用体外细胞培养技术,采用不同浓度的sorafenib和PDGF-BB 20ng/mlg干预HSC,同时与ERK特异性阻滞剂PD98059和PI3K特异性抑制剂LY294002作对比,应用Western blot方法检测HSC和肝组织ERK、p-ERK、Akt和p-Akt的表达。采用免疫组织化学方法测定p-ERK和p-Akt在肝纤维化大鼠肝组织的表达。结果:①Sorafenib对HSC-T6和LX-2细胞总ERK和总Akt蛋白的表达无影响:总ERK和总Akt蛋白在HSC-T6各实验组表达无差异,P值分别为0.16和0.24;在LX-2各实验组差异亦无显著性,P值分别为0.26和0.17。②Sorafenib抑制HSC-T6的信号分子ERK和Akt的磷酸化:PDGF-BB刺激可使HSC p-ERK和p-Akt表达分别提高1.27倍(P=0.071)和1.48倍(P<0.001)。sorafenib 2.5μM、5.0μM和10.0μM干预PDGF-BB激活的HSC,p-ERK蛋白表达分别下调24.24%、34.85%和50%,P<0.01;p-Akt蛋白表达分别下调25.15%、40%和50.29%,明显低于PDGF组,P<0.01。在2.5～10.0μM浓度范围内,sorafenib剂量依赖性抑制HSC-T6 p-ERK和p-Akt蛋白表达, P<0.01。③Sorafenib抑制LX-2细胞p-ERK和p-Akt蛋白的表达:PDGF-BB刺激使LX-2细胞p-ERK和p-Akt提高1.61倍和1.23倍,与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。2.5μM、5.0μM和10.0μM的sorafenib干预PDGF-BB刺激的LX-2,p-ERK表达分别下调60.38%、69.81%和73.58%;p-Akt表达分别下调32.12%、36.50%和45.26%,低于PDGF组,P<0.05。④Sorafenib对信号分子发挥了与特异性阻断剂相似的抑制作用:不论是否有PDGF-BB刺激,ERK特异性阻断剂PD98059和Akt特异性阻断剂LY294002均分别显著抑制了HSC ERK和Akt的磷酸化,而sorafenib则同时对ERK和Akt的磷酸化具有抑制作用。sorafenib对HSC-T6细胞p-ERK和p-Akt的抑制率与PD98059和LY294002的抑制作用无差异,P值分别为0.24和0.11。在LX2细胞中与HSC-T6细胞中的结果一样。⑤Sorafenib抑制实验性肝纤维化大鼠ERK和Akt的磷酸化:Western blot显示,随着肝纤维化进展,大鼠p-ERK和p-Akt的表达逐渐增高,sorafenib治疗2周后,p-ERK和p-Akt的表达受到抑制,在20mg/kg和40mg/kg治疗组,BDL大鼠p-ERK蛋白表达分别下调39.82%和46.02%,P<0.01;p-Akt表达下调38.75%和40%,P<0.05。免疫组化显示在正常大鼠,p-ERK和p-Akt呈弱阳性表达。随着肝纤维化进展,BDL大鼠肝组织p-ERK和p-Akt表达增多,主要分布于汇管区、Disse间隙、纤维间隔的间质细胞,部分肝细胞亦呈强阳性表达。Sorafenib治疗2周后p-ERK和p-Akt表达明显减低。在DMN大鼠得到同样的结果。结论:Sorafenib抑制了HSC和纤维化大鼠肝组织ERK和Akt的磷酸化,阻断了ERK/MAPK和PI3K/Akt信号通路;BDL和DMN大鼠肝纤维化形成过程中,p-ERK和p-Akt表达增加;Sorafenib减轻肝纤维化可能与抑制肝纤维化大鼠p-ERK和p-Akt表达有关。