【摘 要】
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轮状病毒（Rotavirus,RV）是造成婴幼儿及幼龄动物严重腹泻的重要肠道病原体之一,据报道轮状病毒中A、B、C、E、H五群可感染仔猪并导致其发病,其中A群轮状病毒（RVA）是引起仔猪腹泻的主要亚群。仔猪感染RVA后表现为厌食不安,严重者出现大容量腹泻、脱水等临床症状。流行病学调查结果显示:目前G12型轮状病毒在人及猪群中广泛流行,是继G1-G4、G9后的第六大基因型。猪被认为是轮状病毒在人与动
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轮状病毒（Rotavirus,RV）是造成婴幼儿及幼龄动物严重腹泻的重要肠道病原体之一,据报道轮状病毒中A、B、C、E、H五群可感染仔猪并导致其发病,其中A群轮状病毒（RVA）是引起仔猪腹泻的主要亚群。仔猪感染RVA后表现为厌食不安,严重者出现大容量腹泻、脱水等临床症状。流行病学调查结果显示:目前G12型轮状病毒在人及猪群中广泛流行,是继G1-G4、G9后的第六大基因型。猪被认为是轮状病毒在人与动物间传播的储存宿主,可发生基因重组及重配事件,产生新的基因型突破疫苗保护,对养猪业造成巨大的经济损失。而我国仅有针对G5型轮状病毒的疫苗,无法对猪群起广泛的保护作用。因此本实验以G12基因型猪轮状病毒（Porcine Rotavirus,Po RV）为研究对象,开展病毒分离、全基因组测序和遗传演化以及病毒致病性分析、检测方法建立等相关内容,为我国Po RV防控提供理论基础。首先,对我国当前猪群中流行的轮状病毒基因型进行流行病学调查。采集四川、山东等多个省份仔猪腹泻样品,针对VP7基因进行PCR检测,通过BLAST鉴定其基因型。结果显示:34份样品鉴定为G12型轮状病毒,表明该基因型开始在我国流行。将鉴定为G12型的粪便样品接种于MA104细胞,传代七次后可见明显的细胞病变,通过电镜、PCR、间接免疫荧光等方法证明成功分离到G12型轮状病毒株,将其命名为CN127。为进一步研究CN127毒株同其他基因型毒株的遗传相关性,获得了其全基因组序列并进行了核苷酸相似性及基因型分析,结果表明CN127基因型为G12-P[7]-I1-R1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1,表现为Wa样毒株骨架。VP7、VP6、VP1、NSP2、NSP3与人轮状病毒株同源性高,VP3与大熊猫源轮状病毒相似度高,其余片段均与猪源轮状病毒有较高相似度,表明CN127株是由人、猪轮状病毒重配产生。其次,为了解G12型轮状病毒对仔猪的致病力强弱,将P7病毒(10~7TCID50)口服感染未吮初乳的仔猪,通过观察仔猪攻毒后的临床症状、测定肠道排毒量及各组织脏器病毒载量、病理学及免疫组化等方式进行综合评价。结果显示,G12P[7]型轮状病毒可引起仔猪腹泻脱水甚至死亡;导致仔猪胃肠道、肺脏、肝脏及肠系膜淋巴结病变;多个组织脏器包括外周血中均检测到较高水平的轮状病毒核酸。免疫组织化学结果显示十二指肠及空肠内检测到CN127抗原,肠道外组织肺脏检测结果也呈阳性。说明CN127毒株感染仔猪可产生典型的A群轮状病毒症状,且对仔猪有较强的致病性。为区分G12型轮状病毒,将目前流行的G1、G5、G9、G12基因型VP7序列进行比对,通过引物筛选及条件优化,成功建立了基于VP7的RT-PCR方法,筛选出只与G12型反应,与其它基因型不发生反应的特异性引物。由于VP7为轮状病毒重要的中和抗原之一,在不同血清型间差异较大,因此通过将G12型VP7蛋白免疫BALB/c小鼠,成功筛选一株针对VP7的单克隆抗体4-5H-8G,可用于蛋白免疫印迹、间接免疫荧光和免疫组化实验,以此鉴定CN127毒株感染。本研究成功分离了G12型轮状病毒并建立了相应的动物致病模型,为未来轮状病毒疫苗研制提供理论依据。
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