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目的:第一部分:研究脓毒症性AKI小鼠肾脏上TOLL样受体2（TLR2）及其通路分子的表达规律、分布特点并对其机制进行初步探讨。第二部分:探索内毒素-TLR2启动的TLR2-MyD88-NFκB信号传导途径的激活所介导的足细胞损伤在脓毒症性急性肾损伤中的重要影响。第三部分:探索TLR2抑制剂Ortho-vanillin在脂多糖诱导的AKI小鼠中的作用价值,为脓毒症性AKI寻找新的预防和治疗策略奠定理论基础。方法:第一部分:1、小鼠腹腔注脂多糖（LPS）构建脓毒症性急性肾损伤模型,检测LPS小鼠的血肌酐尿素氮、尿蛋白及肾脏病理以明确造模成功。应用实时荧光定量PCR法（Real-time PCR）、免疫组化、免疫荧光染色技术监测TLR2在肾组织的表达分布特点及足细胞上的表达规律,来进行定性和定位。再应用免疫组化法研究TLR2通路分子MyD88及核转录因子（NF-kB,又名p65）在AKI小鼠模型肾组织上的分布及表达情况;2、再加入MyD88抑制剂NBP2-29328及NF-κB抑制剂Celastroland应用RT-PCR法检测LPS小鼠肾组织炎症因子白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA的表达变化情况;3、最后采用免疫组化法检测各组小鼠肾组织凋亡分子Bax和Caspase-3的表达情况。第二部分:1、建立LPS致体外培养足细胞损伤模型,应用免疫蛋白印迹（Western blot）及RT-PCR法检测足细胞各组TLR2蛋白水平及mRNA表达水平,应用ELISA及RT-PCR法检测各组炎症因子IL-6、TNF-α mRNA的表达变化情况;2、再应用Western blot及RT-PCR法检测各组TLR2通路分子MyD88和p65的表达,再应用免疫荧光法观察核转录因子p65被激活后在LPS诱导的足细胞上的亚细胞定位,再在LPS诱导组上加用通路分子MyD88和p65的抑制剂应用ELISA法检测炎症因子IL-6、TNF-αmRNA的表达变化情况;3、接下来进一步应用特定的SiRNA技术,在LPS诱导之前先干扰沉默肾脏细胞内源性TLR2的基因表达,应用Western blot检测各组MyD88和p65的蛋白表达变化水平,应用免疫荧光法观察核转录因子p65向细胞核内转录反应变化情况;RT-PCR检测炎症因子IL-6、TNF-α的表达变化情况;4、提取脓毒症性急性肾损伤患者5%血浆体外刺激足细胞,分为空白组（培养基组,n=8）,阳性对照组（LPS10ug/ml组,n=10）,正常内毒素患者组（内毒素＜7.8pg/ml,n=10）,中等内毒素患者组（内毒素50-100pg/ml,n=10）,高内毒素患者组（内毒素＞200pg/ml,n=10）,应用CCK8细胞活性实验,检测各组足细胞活性。再应用ELISA检测各组细胞上清液炎症因子IL-6、TNF-α的表达水平。第三部分:1、建立LPS致体外培养足细胞损伤模型,将足细胞随机分为4组,LPS 组（n=20）,LPS+OV 治疗组（n=20）,LPS+H2O 对照组（n=10）,NS 空白组（n=10）,利用MTT检测法,检测TLR2抑制剂Ortho-vanillin（OV）对足细胞的细胞毒性,应用Western blot检测各组细胞TLR2的蛋白表达水平,应用免疫共沉淀法检测TLR2与MyD88之间的相互作用。为了探讨OV是否可通过打断TLR2-MyD88之间的相互作用而减轻炎症反应,再应用ELISA法检测各组足细胞上清液的炎症因子IL-6,TNF-α和IL-1β的表达。2、构建LPS脓毒症性急性肾损伤模型,将小鼠随机分为4组,LPS 组（n=20）,LPS+OV 治疗组（n=20）,LPS+H2O 对照组（n=10）,NS 空白组（n=10）,检测各组小鼠血肌酐、尿素氮及肾组织病理,再应用ELISA法检测肾组织上清液IL-6、TNF-α、IL-1β的表达,进一步应用Western blot法检测各组小鼠TLR2及其通路分子核转录因子p65和磷酸化核转录因子（p-p65）的表达。结果第一部分:1、根据血肌酐、尿素氮、尿蛋白及肾脏病理结果提示LPS脓毒症性急性肾损伤模型建模成功;PCR实验显示LPS组小鼠肾组织TLR2mRNA表达明显较生理盐水（NS）组增多（P＜0.01）,免疫组化及免疫荧光实验显示TLR2在正常小鼠肾小球足细胞上低水平表达;经LPS诱导脓毒血症性AKI模型后,TLR2在足细胞上的表达显著升高,且免疫组化证实TLR2通路分子MyD88和NF-κB在AKI模型小鼠肾组织足细胞上表达亦随之升高;2、PCR实验显示与生理盐水组相对照,LPS组肾组织炎症因子IL-6、TNF-αmRNA表达明显增多,且其表达可被MyD88抑制剂及p65抑制剂所抑制,而不能被对照剂JAK1/2抑制剂所抑制;3、免疫组化实验显示与生理盐水组相比,LPS组小鼠肾组织Bax及Caspase-3在肾小球尤其是足细胞上明显表达增多。第二部分:1、应用LPS体外诱导足细胞后,Western blot及RT-PCR实验均显示LPS诱导组较NS组TLR2蛋白水平及mRNA水平均表达明显增加（P＜0.01）,同时ELISA及RT-PCR显示LPS诱导组较NS组IL-6和TNF-α蛋白水平及mRNA水平表达亦明显增加（P＜0.01）;2、LPS诱导组TLR2、MyD88和p65蛋白水平及mRNA水平均表达明显增加,核转录因子p65经LPS刺激24小时被激活后,细胞核内表达明显增加,且加用MyD88和p65抑制剂组后炎症因子IL-6、TNF-α表达较LPS组明显下降,不受JAK1/2通路抑制剂的影响,3、TLR2被SiRNA技术敲除之后,显示LPS诱导的MyD88和p65的蛋白表达水平明显被抑制,而且p65向细胞核内转录反应亦被明显抑制,相应的炎症因子IL-6、TNF-α的表达在TLR2敲除组表达明显减少。4、脓毒症性急性肾损伤患者血浆体外刺激足细胞,随着内毒素水平的升高,足细胞坏死越明显,且炎症因子IL-6、TNF-α分泌明显增多。第三部分:1、体外实验中,Ortho-vanillin作为TLR2抑制剂,首次在体外足细胞上在测试的剂量范围10-150μM之间未显示明显的细胞毒性;Western blot显示,OV未处理过的LPS诱导的足细胞组TLR2明显表达升高,而OV预处理的LPS诱导的足细胞组,TLR2的表达与LPS未诱导的正常组相似;足细胞上免疫共沉淀实验显示LPS可诱导TLR2-MyD88相互作用,而OV可抑制TLR-MyD88的相互作用从而抑制TLR2活化,OV治疗组可显著减轻LPS诱导的足细胞炎症因子分泌;2、体内实验中,Ortho-vanillin在LPS诱导的AKI小鼠模型上可降低血尿素氮及肌酐值及肾组织损伤评分;OV处理组肾组织上清液IL-6、TNF-α、IL-1β的表达明显减少,Western blot显示OV处理组并不能明显减轻TLR2及p65的表达,但可以显著减轻p65的磷酸化。结论:1、脓毒症性急性肾损伤的发生与肾小球足细胞上TLR2-MyD88-NF-kB信号途径的激活密切相关。2、内毒素刺激足细胞分泌大量炎症因子可能是脓毒症性AKI发生的重要始动环节。3、TLR2-MyD88-NF-kB通路可能是内毒素刺激足细胞释放炎症介质的重要途径之一。4、TLR2-MyD88-NF-kB通路激活导致炎症因子的分泌增多及足细胞凋亡,可能是介导脓毒症性AKI发生的重要机制之一。5、TLR2抑制剂Ortho-vanillin,可能通过抑制TLR2活化、抑制NF-κB信号通路的活化而发挥其抗炎及肾保护作用。