棉花与烟粉虱互作相关基因的克隆及功能验证

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:weizx20090123
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棉花作为一种重要的天然纺织资源,在其生长发育过程中总是面临着各种各样植食性害虫的取食,造成大幅度减产。随着BT棉的大面积推广种植,BT非靶标害虫烟粉虱(Bemisia tabaci)、盲椿象等刺吸式昆虫已由次生害虫逐渐上升为主要害虫,因此,研究烟粉虱与棉花互作的分子机制,挖掘潜在的抗虫基因具有重要意义。本课题从棉花与烟粉虱互作的转录组数据中选择了棉花与烟粉虱互作相关的8个基因,分别是GhWRKY18、GhWRKY21、GhWRKY32、GhWRKY40、GWRKY46、GhWRKY70、GhERF105、Gh6PGL2,通过创造这8个基因的RNAi和超表达转基因材料来验证它们在棉花抗虫信号路径中所起的作用。  1、通过构建系统发育树对陆地棉中的WRKY转录因子进行分组,结果显示GhWRKY32属于第Ⅰ组,GhWRKY18和Gh WRKY40都属于第Ⅱ-a组,GhWRKY21属于第Ⅱ-d组,GhWRKY46和GhWRKY70属于第Ⅲ组。通过分析WRKY转录因子在烟粉虱诱导下的表达模式,结果显示这6个WRKY转录因子在陆地棉中可能积极地响应烟粉虱的胁迫。本研究共构建6个RNAi载体和4个超表达载体,通过遗传转化共成功获得43个阳性转基因株系,其中有21个为单拷贝株系。通过Southern blotting和qRT-PCR检测,Ri-GhWRKY18共筛选出5个、Ri-GhWRKY70共筛选出4个表现出良好干涉效果的低拷贝转基因株系,分别是Ri-GhWRKY18-1/2/3/4/6和Ri-GhWRKY70-1/2/3/4。  2、通过分析GhERF105和Gh6PGL2在烟粉虱诱导下的表达模式,结果显示GhERF105和Gh6PGL2在陆地棉中可能积极地响应烟粉虱的胁迫。本研究构建了GhERF105和Gh6PGL2的RNAi载体,通过遗传转化成功获得了能够稳定遗传的阳性转基因株系。通过Southern blotting和qRT-PCR检测,Ri-GhERF105和Ri-Gh6PGL2分别筛选出7个和12个表现出良好干涉效果的转基因株系,分别是Ri-Gh6PGL2-1/2/4/5/7/8/9/11和Ri-GhERF105-7/8/11/12/13/14,所筛选出的转基因株系将作为后续研究棉花抗虫性鉴定的重点。  通过统计所筛选出的低拷贝T1代转基因材料的田间性状分析显示,与对照JIN668相比,各转基因株系的株高极显著的低于对照,大多数的转基因株系对植食性昆虫的抗性都低于对照,尤其是Ri-GhWRKY18和Ri-GhWRKY70在危害等级和危害叶片网孔数等方面的数据都显著的高于对照,推测可能是在棉花中分别干涉GhWRKY18和GhWRKY70之后,引起了棉花对植食性昆虫的抗性减弱以及影响了棉花的基础生长发育。
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