罗伯茨虫草及其近缘种系统学研究

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本研究对采自云南水富铜锣坝的罗伯茨虫草Ophiocordyceps robertsii(Hook.)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones& Spatafora进行详细形态及其分子系统分析。同时,对云南云龙道人山、云龙西六山、云龙鲁庄、兰坪营盘等地采集到的外观形态结构与罗伯茨虫草相似的4种虫草标本进行了形态和分子比较研究。另外,对罗伯茨虫草培养特性、子实体人工诱导、昆虫幼虫感染以及活性成分进行了研究,主要得到如下结论:  对水富铜锣坝、云龙道人山、云龙西六山、云龙鲁庄、兰坪营盘等地采集到的5种虫草标本,进行有性型及无性型形态和显微形态观察,并与近缘种进行比较分析。同时,开展6基因ITS、nrSSU、nrLSU、tef-1a、rpb1、rpb2测序及其系统发育分析。结合形态分析结果,鉴定5种虫草标本都属于线虫草属,其中来自水富铜锣坝的虫草鉴定为罗伯茨虫草O.robertsii(Hook.)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones& Spatafora;来自云龙鲁庄的虫草鉴定为兰坪虫草O.lanpingensisH.Yu,Z.H.Chen& Y D.Dai,来自兰坪营盘的虫草与云龙西六山的拟凉山虫草为同种虫草,鉴定为线虫草属一新种,暂命名为拟凉山虫草O.notholiangshanensis sp.nov.Yu,Guo& Dai;来自云龙道人山的虫草鉴定为线虫草属一新种,暂命名为道人山虫草O.daorenensis sp.nov.Yu,Guo& Dai。  对罗伯茨被毛孢菌株HRT05进行培养特性研究,以菌落直径和菌落干重为指标,从6种碳源中筛选出最适碳源为蔗糖,从6种氮源中筛选出最适氮源为蚕蛹粉。以菌落直径为指标,采用正交实验筛选固体培养HRT05菌株培养基配方,最优组合为:蔗糖5%,蚕蛹粉1%,MgSO40.20%,琼脂2%,最适培养温度为15℃,最适培养pH值为5.5。罗伯茨被毛孢菌株HRT05在优化后的培养条件下培养84d,菌落直径可达3.628 cm,较PPDA培养基生长速度增加了40.83%。  根据优化出的培养条件,开展罗伯茨被毛孢子实体诱导的研究,优化培养基为20g新鲜蚕蛹,加入蔗糖2%,蛋白胨1%,KH2PO40.05%,MgSO40.1%,Vb10.02%,Vb60.04%,烟酸0.04%的营养液40ml。接种后4℃黑暗培养60天,转入15℃培养,每天散射光照射7hr,60天左右,增加光照时间(12hr),继续培养180天后子实体原基产生,继续培养30天后子实体长出3cm左右,子实体形态与罗伯茨虫草子座颜色质地相似。  利用罗伯茨被毛孢通过涂布法、饲喂感染、注射法感染活体四龄家蚕和黄粉虫。罗伯茨被毛孢生长缓慢,与杂菌的竞争中处于劣势,因此对活体昆虫感染率不高。以虫体断面菌丝形态显微观察为指标,饲喂法感染黄粉虫的感染率最高为20%,涂布法感染家蚕的感染率最高为10%。  通过UV(比色法)及HPLC(高效液相色谱法)检测罗伯茨虫草和罗伯茨被毛孢的主要活性成分,并与西藏那曲的冬虫夏草以及云南兰坪的兰坪虫草进行比较。罗伯茨虫草主要活性成分种类与冬虫夏草、兰坪虫草相同;其中,罗伯茨虫草甘露醇、尿苷、鸟苷、腺嘌呤、腺苷含量与冬虫夏草接近,多糖和虫草素含量与冬虫夏草差距较大,而尿嘧啶含量高于冬虫夏草。罗伯茨虫草腺苷和尿嘧啶含量高于兰坪虫草,多糖和虫草素含量与兰坪虫草相差较大,甘露醇、尿苷、鸟苷、腺嘌呤含量与兰坪虫草接近。分离出的罗伯茨被毛孢优良菌株HRT06,其多糖,尿苷,鸟苷,腺苷含量与其余菌株含量差异显著(P<0.05),且菌株HRT06腺苷含量为140.162μg·g-1,是10株罗伯茨被毛孢中唯一腺苷含量达到中国药典冬虫夏草规定腺苷含量不得少于100μg·g-1的菌株。罗伯茨被毛孢通过液体发酵,15℃摇床培养21天,静置培养60天,每瓶平均可产菌2-3g(干重)。  综上所述,本研究对水富铜锣坝、云龙西六山、云龙鲁庄、兰坪营盘等地采集到的5种虫草标本,进行系统学研究,澄清5种虫草标本的相互间关系,鉴定5种虫草标本都属于线虫草属,其中水富虫草为罗伯茨虫草O.robertsii(Hook.)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones&Spatafora;来自云龙鲁庄的虫草为兰坪虫草O.lanpingensis H.Yu,Z.H.Chen& Y D.Dai;来自兰坪营盘的虫草与云龙西六山的虫草均为线虫草属一新种,暂命名为拟凉山虫草O.notholiangshanensis sp.nov.Yu,Guo& Dai;来自云龙道人山的虫草为线虫草属一新种,暂命名为道人山虫草O.daorenensis sp.nov.Yu,Guo& Dai。
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