银鲫和彩鲫Hira基因的表达分析

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Hir/Hira(histone regulation)为组蛋白调节基因,是组蛋白基因表达的一种负调节因子。Hira基因产物包含一组保守的蛋白家族,广泛存在于从植物、酵母、果蝇、鱼、爪蟾、鸡以及到哺乳动物小鼠和人类等多种生物体当中,但有关其在生物体发育过程中的具体功能还不甚清楚。对果蝇的研究表明,Hira基因产物可能在受精时精核的解凝过程和雄性原核的正常形成过程中起重要作用。 在本实验室前期已经分别克隆出雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫的Hira基因(CagHira和CaHira)的基础之上,本研究首先采用半定量RT-PCR的方法分别研究了CagHira和CaHira基因在银鲫和彩鲫不同胚胎发育阶段的转录表达情况。结果显示,在银鲫的未受精卵中和胚胎发育不同阶段均可以检测到转录产物,且表达量没有明显变化,表明Hira基因可能在银鲫雌核发育过程中发挥一定作用;而在彩鲫中,从未受精卵到胚胎发育的各个时期虽然均可检测到表达,但表达量发生明显波动,受精卵中转录本水平较高,受精后迅速降低,在受精后30min、多细胞期、桑椹期、囊胚期等四个发育阶段,转录本水平显著下降(p<0.05),至原肠期表达量又上升到成熟的未受精卵时的水平,并一直保持到出苗,没有大的波动。Hira基因在两亲缘种成熟卵子受精前后表达情况不同,可能与两种鱼不同的生殖方式有关。同时我们也采用胚胎整体原位杂交的方法检测了CagHira在银鲫胚胎发育阶段的定位情况。结果显示,CagHira基因的转录本在银鲫胚胎发育早期广泛分布,而在胚胎发育后期主要集中于头部、神经轴、心脏及尾芽尖部,表明其对其神经系统和心脏的发育有一定作用。 为了进一步研究Hira基因在鱼类发育过程中的作用,我们制备了银鲫CAGHIRA蛋白的抗体。根据银鲫CagHira基因的特异区域,设计一对引物,以银鲫成熟卵母细胞总RNA逆转录出的cDNA为模板,扩增出Hira基因的特异片段,构建原核表达载体,诱导重组蛋白表达,用纯化的蛋白免疫小鼠,获得了银鲫HIRA蛋白的多克隆抗体.Western blot实验结果表明,其特异性好,效价也比较高。 对银鲫HIRA蛋白的组织特异性表达分析发现,该蛋白仅在成熟卵巢组织中特异表达,故表明HIRA可能对鱼类卵子发生和/或早期胚胎发育具有重要作用;对彩鲫HIRA蛋白的组织特异性表达分析发现,彩鲫HIRA蛋白在卵巢、脑、心、肝、脾、肾中均有表达,在卵巢和肝脏中表达较强,而肌肉和精巢的表达量相对较低,表明它可能在卵巢发育和卵子发生过程中发挥一定作用。 对银鲫和彩鲫不同胚胎发育阶段HIRA蛋白表达分析表明,未受精卵和胚胎发育不同阶段的HIRA蛋白的表达与RT-PCR实验所得结果一致,在银鲫中表达量没有较大变化,而在彩鲫的受精后30min、多细胞期、桑椹期、囊胚期等四个发育阶段蛋白表达量下降。 在果蝇中的研究已经表明Hira基因与精核解凝形成雄性原核有关。由于彩鲫是两性生殖方式鱼类,在受精前.Hira基因大量表达,可能为受精时精子进入卵后精核解凝形成雄性原核做准备。而银鲫具有雌核发育生殖方式,精核不需要完全解凝形成雄性原核,只是起到刺激卵核发育的作用,因此Hira基因的表达水平没有大的波动。这说明,Hira基因可能在鱼类精核解凝过程中也发挥重要作用。彩鲫后期合子型Hira基因的激活以及银鲫不同胚胎发育阶段都监测到Hira基因表达,说明 Hira基因可能在鱼类胚胎的后期发育过程中也起着一定的作用。实际上,胚胎整体原位杂交的结果已经初步表明CagHira基因对银鲫神经系统和心脏的发育可能有一定功能。
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