论文部分内容阅读
前言： 肺癌是当今世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，约占恶性肿瘤致死率的30％。肺癌中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）约占85％，其中主要包含两种组织学类型:腺癌和鳞癌。肺癌的防治是全世界共同面对的一项难题，尽管针对肺癌的外科手术、化疗和放疗的已取得长足进步，但疗效依旧不理想，五年生存率很低。 丝裂原诱导基因6（mitogen-inducible gene-6，Mig-6）最早是在对细胞周期的研究中发现的。Mig-6是一种早期反应基因，可受多种细胞外刺激诱导，例如生长因子、低氧状态和压力信号等。据文献报道，它在人体分布广泛，可以负向调控表皮生长因子受体(EGFR)下游靶基因的活化，在小鼠模型中，下调Mig-6的表达，可引起肺、膀胱、胆管以及消化道的肿瘤发生，提示Mig-6并可能与多种肿瘤的发生有密切关系。进一步研究提示，Mig-6在多种人类肿瘤中表达下调，提示其可能扮演着抑癌基因的角色。 但是，Mig-6在非小细胞肺癌中的表达及其与临床病理因素的关系尚不明确，Mig-6的变化对肺癌细胞凋亡的影响也未有研究。为了明确以上问题，我们检测了NSCLC中Mig-6的表达情况，分析了Mig-6表达与临床病理因素及患者预后的关系，并进一步探讨了Mig-6对肺癌细胞凋亡的影响及其相关机制。 材料与方法： 1、组织标本来源 本研究获得中国医科大学伦理委员会的批准，150例肺癌组织及20例癌旁正常肺组织（距原发肿瘤边界5cm以上）收集自2007-2012年在中国医科大学附属第一医院手术的病人，组织经10％中性福尔马林固定，石蜡包埋。这些患者在手术前均未接受放化疗，并已知情其切除组织用于诊断后剩余部分会被保存及用于科学研究，其医疗记录会被用于后续随访，但隐私会被严格保密。肿瘤的组织学诊断、分化程度和分期通过伊红苏木素染色后根据世界卫生组织分类标准和国际抗癌联盟的肺癌TNM分期标准（第七版）进行判定。150例肺癌标本中，鳞癌69例，腺癌81例，伴发淋巴结远端转移60例。 2、细胞培养和转染 肺癌细胞系H1299，A549和H157细胞系购自美国模式菌种收藏所，BE1细胞系由北京大学郑杰教授惠赠。细胞使用RPMI1640培养基含10％的灭活小牛血清培养，并于实验前24小时传代至六孔板中。Mig-6过表达质粒pcDNA3-Mig-6和对照空载体pc-DNA3均为商业化质粒，质粒转染试剂为Attractene。Mig-6特异性siRNA和对照乱序siRNA购自GenePharma。siRNA转染试剂为DharmaFECT1。mRNA和蛋白检测均在转染或干扰后48小时进行。 3、免疫组织化学染色 组织经10％中性福尔马林固定，石蜡包埋。将石蜡包埋的肺癌组织块切成4μm厚切片，癌旁的正常支气管上皮作为阴性对照。以PBS代替一抗作为空白对照。使用即用型非生物素免疫组化EliVisionTM plus检测试剂盒（迈新，福州，中国）及Mig-6多克隆抗体(1∶100)进行免疫组化染色。两位病理医生对切片分别作出判定，每张组织切片随机观察5个高倍视野(×400)，每个视野共计数100个癌细胞，阳性率根据阳性癌细胞所占百分比计算。Mig-6表达主要位于细胞质，也可在细胞核中表达。免疫组化结果评判方法参考本研究课题组前期文献报道，每个病例的Mig-6的阳性率1％～25％为1分、＞25％～50％为2分、＞50％为3分，染色强度分为0分（无着色）、1分（弱）、2分（强）。阳性率与强度评分相乘:当＞10％的癌细胞染色阳性时则该病例定义为表达阳性，＜3分为阴性表达，≥3分为阳性表达。 4、免疫蛋白印迹 使用蛋白裂解液从细胞系中提取总蛋白并使用Bradford法定量分析。使用浓度为12％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对60mg蛋白进行分离，并将蛋白转印至聚偏氟乙烯膜上后在4℃使用下列抗体过夜孵育:抗Mig-6(1∶2000)，抗β-actin(1∶500)，抗bcl-2(1∶500)和抗磷酸化ERK(1∶2000)。相对蛋白表达水平以β-actin作为加样对照进行计算。 5、实时定量PCR（SYBR Green法） 对于新鲜培养的细胞采用RNeasy plus Mini kit提取总RNA。使用SYBRGreen PCR master mix(Applied Biosystems)进行定量real-time PCR扩增，反应体系总体积为20μl。使用7900HT实时定量PCR仪过程如下:95℃，30秒;95℃，5秒，40个循环;60℃，30秒。引物序列见（表1）.β-actin作为内参.基因相对表达水平计算方式如下△Ct=Ct gene-Ct reference，增加倍数用如2-△△Ct方法计算，每次试验均做三个重复孔。 6、细胞凋亡检测 运用AnnexinⅤ-FITC/PI双染试剂盒，收集细胞后经冷PBS冲洗后使用结合缓冲液悬浮，并调整细胞密度至2-5×105/ml，于暗室中在195ul体系中加入5μlAnnexinⅤ-FITC室温孵育10分钟后加入190μl结合缓冲液(1×)和10μl PI。使用FACScan流式细胞仪进行检测并使用CellQuest分析软件分析数据。 7、统计分析 各组资料利用SPSS13.0软件进行统计分析。运用卡方检验分析Mig-6表达与临床病理参数的相关性;运用Kaplan-Meier和Log-rank生存分析患者预后并行组间比较;运用Cox回归模型进行多因素分析。P值小于0.05提示具有统计学意义。 结果： 1、Mig-6蛋白表达的临床意义。 我们用免疫组化的方法检测了150例非小细胞肺癌及其癌旁正常组织中Mig-6蛋白表达情况。Mig-6主要在细胞浆和细胞核中表达。在正常支气管上皮中Mig-6表现出胞浆和胞核的强阳性表达而在肿瘤细胞中Mig-6的蛋白表达下调。我们又分析了Mig-6的表达和临床病理因素之间的关系发现，Mig-6的表达缺失和高TNM分期(Ⅰ+Ⅱ vs.Ⅲ+Ⅳ，p=0.014)、低组织分化（高vs.中低，p=0.002）以及鳞癌（鳞癌vs.腺癌，p=0.005）存在关系，与其他诸如性别、年龄和淋巴结转移无关。 2、Mig-6的表达与肺癌患者预后的关系 Kaplan-Meier生存分析表明，与Mig-6阳性表达的患者(n=26)相比，Mig-6阴性表达患者(n=34)的平均生存时间显著缩短(45±11.132月vs.13±1.458月)。回归分析（Cox模型）显示TNM分期和Mig-6的表达同为影响肺癌不良预后的独立因素（p值分别为0.000和0.005）。 3、通过Mig-6特异性siRNA干扰和转染表达Mig-6的质粒双向调控肺癌细胞系中Mig-6的表达 根据本研究课题组前期文献报道，Mig-6在H1299和BE1细胞中高表达，而在A549和H157细胞中低表达。在H1299和BE1细胞系中转染Mig-6特异性siRNA，转染后48小时运用western blot法和实时定量PCR证实Mig-6在H1299和BE1细胞系中蛋白和mRNA表达水平均明显下调。在A549和H157细胞中转染表达Mig-6的质粒，转染后48小时运用western blot法和实时定量PCR证实Mig-6在A549和H157细胞系中蛋白和mRNA表达水平均明显升高。 4、Mig-6对肺癌细胞凋亡的影响 在H1299和BE1细胞系中转染Mig-6特异性siRNA，运用western blot法检测Bcl-2蛋白的表达显示Bcl-2蛋白表达水平上调，流式细胞术检测显示细胞凋亡受到抑制（H1299对照vs.Mig-6 siRNA:11.54±0.65 vs.6.10±1.29％，p＜0.01;BE1对照vs.Mig-6 siRNA:12.63±0.96 vs.6.42±0.83％，p＜0.01）。在A549和H157细胞中转染表达Mig-6的质粒，运用western blot法检测Bcl-2蛋白的表达显示Bcl-2蛋白表达水平受到抑制，流式细胞术检测显示细胞凋亡率明显升高（A549空载体vs.Mig-6质粒:7.05±0.82 vs.13.98±0.79％，p＜0.01;H157空载体vs.Mig-6质粒:12.46±0.87vs.17.35±1.44％, p＜0.05)。 5、Mig-6通过ERK调控Bcl-2表达和细胞凋亡 在H1299和BE1细胞系中转染Mig-6特异性siRNA，并用ERK特异性抑制剂PD98059预处理或共转染ERK特异性siRNA，运用western blot法检测ERK、pERK和Bcl-2蛋白的表达，运用流式细胞术检测显示细胞凋亡率，结果显示:抑制ERK活化可逆转Mig-6表达缺失导致的Bcl-2表达上调及凋亡抑制。在A549和H157细胞中转染表达Mig-6的质粒，并用ERK特异性抑制剂PD98059预处理，运用westernblot法检测pERK和Bcl-2蛋白的表达，运用流式细胞术检测显示细胞凋亡率，结果显示:抑制ERK信号转导通路与过表达Mig-6的效果一致，可下调Bcl-2的表达并促进细胞凋亡。 结论： 1、Mig-6表达缺失与非小细胞肺癌的组织学分型（鳞癌）、低分化和高TNM分期相关，与患者的性别、年龄及淋巴结转移无关。 2、Mig-6表达缺失与患者的不良预后相关，是独立的预后危险因素。 3、Mig-6抑制ERK信号转导通路、下调Bcl-2的表达并进一步促进肺癌细胞凋亡。 4、Mig-6表达缺失可上调Bcl-2并抑制肺癌细胞的凋亡。 5、Mig-6对肺癌的恶性演进具有负向调控能力，发挥着抑癌基因的作用。