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TrkB,称为酪氨酸激酶受体B,是目前人们已经克隆出来三种酪氨酸激酶受体(Tyrosine kinase receptors,TRKs),即TrkA、TrkB及TrkC之一,是脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的特异性受体。近年研究发现许多肿瘤中可见TrkB的过度表达或过度激活,如神经母细胞瘤(NB)、多发性骨髓瘤(MM)等。一些非神经源性的肿瘤均发现有TrkB受体的表达,如何杰金淋巴瘤、肾母细胞瘤以及肝、肺、胰腺癌等。甚至在EB病毒转化的B淋巴细胞中也有表达。研究表明,TrkB可能为一种癌基因,通过激活P13K/Akt诱导细胞存活和增殖,抑制失巢凋亡的产生,促进肿瘤细胞的浸润和转移。“失巢凋亡”是一种特殊的程序化细胞死亡形式,多发生在与基质粘附的细胞。一般正常的细胞都会团聚在一起,粘附于细胞外基质中,通过相互的物质与信号交流得以生存。一旦他们脱离细胞粘附基质,失去细胞间的联接,则会遭受细胞凋亡,与正常细胞不同的是,肿瘤细胞失去了脱离细胞群体而遭受凋亡的特性,具备了抵抗失巢凋亡的能力。这些具有抗失巢凋亡能力的肿瘤细胞能够在一个缺乏细胞生存所需的信号传导的条件下生存。鼻咽癌是中国南方常见的恶性肿瘤。鼻咽癌颈部淋巴结具有转移早、转移率高的特点。目前鼻咽癌的转移浸润机制仍然不明确。有关失巢凋亡在鼻咽癌方面的研究,尤其是TrkB调控的失巢凋亡方面没有报道。本研究旨在探讨鼻咽癌失巢凋亡特性,以及TrkB对其失巢凋亡特性的影响,并且研究了TrkB在鼻咽癌组织中的表达以及其与临床指标的关系。目的:1.研究TrkB在鼻咽癌组织中的表达,探讨其与鼻咽癌发生发展以及临床分期的关系。2.明确鼻咽癌细胞系的抗失巢凋亡特性。3.明确TrkB在鼻咽癌细胞系中的表达,探讨其对鼻咽癌细胞系失巢凋亡特性的影响和调控。方法:1.TrkB在鼻咽癌组织中的表达研究采集57例鼻咽癌患者鼻咽部标本,以及20例作为正常对照的鼻咽部标本。27例颈部淋巴结转移癌标本,以及20例作正常对照的颈部淋巴结标本。(1)免疫组化研究这57例鼻咽癌组织中TrkB、BDNF以及VEGF在组织中的表达情况。探讨它们与临床特征的关系以及它们之间的关系。(2)免疫组化检测了27例颈部淋巴结转移癌的标本中TrkB的表达。(3)实时荧光PCR法检测57例鼻咽癌组织中TrkB mRNA的表达,并与其临床特征作比较研究。2.鼻咽癌细胞系抗失巢凋亡特性的检测。采用鼻咽癌细胞系CNE-2、C666-1、TW03以及正常鼻咽上皮细胞系NP69作为正常对照。采用如下方法检测其失巢凋亡:(1)软琼脂实验:观察细胞集落形成率。(2)悬浮培养:观察细胞形态和集落形成,并采集细胞作凋亡检测。(3)Annexin V-PI双染色流式细胞计检测检测凋亡(4)吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)双染色荧光显微镜观察凋亡3.检测TrkB在鼻咽癌细胞系中的表达,并探讨其对鼻咽癌细胞失巢凋亡的影响和机制。采用TrkB高表达的细胞系C666-1作为研究对象,采用TrkB的抑制剂K252a以及其配体BDNF作为激活剂分别作用于C666-1,观察它们对C666-1的生长、凋亡的影响。并通过Western blot检测TrkB、BDNF、p-AKT等蛋白的表达情况。(1)RT-PCR以及Western blot检测C666-1、CNE-2、TW03细胞系TrkBmRNA以及蛋白的表达。(2)软琼脂实验:用C666-1细胞做研究对象,分别用400nM浓度的K252a,以及200ng/ml的BDNF,与C666-1共孵育2W,观察细胞集落的大小。(3)细胞聚集现象分析:用不同浓度的K252a以及BDNF分别孵育C666-172小时,观察细胞形态变化。并采集细胞做以下实验。(4)CCK-8实验:观察不同浓度的K252a以及BDNF分别作用C666-172小时后细胞的增殖率。(5)AO/EB双染色荧光显微镜观察凋亡情况。(6)Annexin V-PI法凋亡检测(7)Western Blot检测作用前后TrkB、BDNF、p-AKT等蛋白的表达情况。结果:1.TrkB在鼻咽癌组织中与临床分期以及有无淋巴结转移有关。(1)TrkB与BDNF以及VEGF蛋白表达及其关系:在57例鼻咽癌组织中47例表达TrkB阳性(82.5%);30例表达BDNF阳性(52.6%);43例表达VEGF阳性(75.4%)。而20例对照组中只有6例表达TrkB阳性(30%);4例BDNF阳性(20%),5例表达VEGF阳性(25%)。经统计分析均有显著性意义,P＜0.05。NPC组织中VEGF表达与TrkB表达呈正相关(r=0.747,P＜0.05)。(2)TrkB、BDNF与VEGF蛋白的表达与临床指标的关系:在T分期中,T1+T2与T3+T4中的TrkB、VEGF表达有显著性差异。在有淋巴结转移和无淋巴结转移的患者中,TrkB、BDNF与VEGF均有显著性差异,在临床分期中,Ⅰ+Ⅱ与Ⅲ+Ⅳ期中TrkB、VEGF的表达存在显著性差异。(3)在淋巴结转移癌中TrkB蛋白的表达:在27例鼻咽癌的淋巴结转移癌中,有19例表达TrkB蛋白阳性。表达阳性率达到了70.4%。而正常对照组20例淋巴结中,只有5例表达阳性。经统计学分析,有显著性意义,P＜0.05。(4)鼻咽癌中TrkB mRNA表达强度与临床病理参数的关系:有无淋巴结转移(N0和N1-3)和临床分期(Ⅰ+Ⅱ与Ⅲ+Ⅳ期)中,TrkB的表达存在显著性差异,P＜0.05。2.鼻咽癌细胞株CNE-2、C666-1、TW03均具有抵抗失巢凋亡的特性。(1)各种鼻咽癌细胞均能在软琼脂上形成集落,并在培养24h后即可出现,1W内形成的集落速度较快。(2)悬浮培养细胞的鼻咽癌细胞同样出现细胞集落,而NP69细胞不未见细胞集落出现。(3)悬浮培养细胞的鼻咽癌细胞在培养48h后凋亡率并没有升高。而NP69细胞则出现了凋亡。3.TrkB对鼻咽癌细胞的失巢凋亡具有抑制作用,并通过PI3K/AKT信号传导调控失巢凋亡。(1)鼻咽癌细胞株C666-1表达TrkB及其配体BDNF。(2)C666-1受TrkB抑制剂K252a后在软琼脂中集落细胞数减少,而在BDNF作用下,集落细胞数增加。(3)在悬浮培养状态,K252a与C666-1细胞的存活率有剂量依赖性,以400nM时细胞的增殖率被抑制比较明显。而BDNF与C666-1细胞的增殖率也成剂量依赖性。以200ng/ml时细胞的存活率提高明显。(4)K252a抑制C666-1细胞TrkB表达,并同时下调p-AKT蛋白。降低了Akt蛋白的活性,从而诱导凋亡。(5)BDNF作用后内源性BDNF表达的增强以及TrkB和p-Akt上调。结论:1.鼻咽癌细胞系CNE-2、C666-1、TW03具有抵抗凋亡的特性。2.TrkB具有抑制鼻咽癌细胞失巢凋亡的作用,并通过AKT激酶信号传导调控失巢凋亡。3.K252a能够抑制TrkB的信号通路从而诱导凋亡,是有潜力的酪氨酸激酶抑制剂。4.TrkB在鼻咽癌组织以及淋巴结转移癌中存在高表达,其在鼻咽癌组织中的表达又与VEGF相关,并与临床分期以及有无淋巴结转移等因素有关系。因此,我们的研究表明TrkB作为肿瘤失巢凋亡的抑制因子,对鼻咽癌的转移浸润具有重要的影响。特异性阻断其信号传导通路或者直接封闭TrkB的功能区,将有助于抑制肿瘤的转移,为临床治疗鼻咽癌找到新的突破点。