论文部分内容阅读
常规方法进行哺乳动物卵母细胞体外成熟培养时，由于离开了卵泡环境而使卵母细胞内环腺苷酸单磷酸核苷酸(3’,5’-cyclic adenylate monophosphate,cAMP)的水平迅速下降，进而引起减数分裂提早恢复，而此时卵母细胞胞质并未完全成熟，即会使得卵母细胞核质成熟不同步，最终导致体外成熟培养的卵母细胞后续发育能力降低。在卵母细胞成熟过程中，纺锤体正确组装并具有正常形态是减数分裂中染色体正常分离和细胞器正常分布的基础，并且直接影响卵母细胞的成熟质量和后续发育能力。为了提高卵母细胞体外成熟质量和后续发育能力，至今已有多种能阻滞减数分裂恢复的物质被用来诱导体外培养卵母细胞的核质同步成熟，C-型钠肽(C-type natriuretic peptide,CNP)便是其中之一。虽然科学家们普遍认为CNP提高卵母细胞成熟率和后续发育能力是通过维持减数分裂阻滞，为卵母细胞的胞质成熟争取到了更多的时间。但是，在卵母细胞成熟过程中CNP是否能通过某些信号转导途径直接或间接地对卵母细胞的胞质成熟（特别是对纺锤体形态）进行调节，尚未有明确的研究证据。 本研究通过研究CNP对MⅡ纺锤体形态的影响及其对纺锤体组装相关基因在卵母细胞核成熟过程中的表达的影响，探讨CNP对小鼠卵母细胞胞质成熟的影响，进一步揭示CNP在卵母细胞成熟过程中的作用及其调控机制。 研究内容和结果如下： (1)为了检测CNP对小鼠卵母细胞体外培养核成熟和MⅡ纺锤体形态的影响，首先从PMSG处理24h时小鼠卵巢采集生发泡(germinal vesicle,GV)期卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)，将COCs分别在含有50nM CNP的培养液中减数分裂阻滞培养24h后，再于含10ng/mL EGF的常规成熟培养液中培养16h（CNP阻滞培养试验组）；或将COCs直接在含10ng/mL EGF的常规成熟培养液中培养16h（体外对照组）；或从PMSG处理48h后hCG处理16h时小鼠输卵管采集体内成熟卵母细胞（体内对照组）。收集培养结束后的COCs，脱卵丘细胞后的卵母细胞用Hoechst33342染色，观察卵母细胞的染色质形态，以判断其核成熟进程，并结合极体排出的情况统计各组卵母细胞核成熟率。结果显示，CNP阻滞培养试验组卵母细胞的核成熟率(78.47±5.24%)显著高于体外对照组(57.53±3.20%)(P<0.05)，说明经过CNP阻滞培养24h再常规成熟培养的卵母细胞，其核成熟率得到显著提高。然后采用免疫荧光技术，观察成熟卵母细胞MⅡ纺锤体形态，并统计各组成熟卵母细胞中具有正常MⅡ纺锤体形态的卵母细胞比率。结果显示，CNP阻滞培养试验组卵母细胞中纺锤体正常比率(76.03±2.46%)，显著高于体外对照组(54.73±2.37%)(P<0.05),并且与体内对照组卵母细胞(82.00±3.48%)无显著差异(P>0.05).说明CNP的参与显著促进了小鼠卵母细胞成熟过程中纺锤体正确组装。 (2)CNP下游最主要的作用通路是cAMP-PKA通路，为了检测CNP是否通过该通路促进小鼠卵母细胞成熟过程中正常纺锤体的形成，首先采用ELISA技术检测了采用添加或不添加CNP的培养液分别培养小鼠COCs2h后卵母细胞内cAMP水平。结果显示，使用不添加CNP的培养液体外培养COCs2h时，卵母细胞内cAMP水平(0.155±0.037pmol/mL)显著低于添加CNP组卵母细胞cAMP水平(0.582±0.047pmol/mL)(P<0.05)，说明CNP显著提高了CNP体外阻滞培养时卵母细胞内cAMP水平。然后使用能升高cAMP水平的PDE3A抑制剂Milrinone和PKA的抑制剂H89进行进一步的试验。除CNP阻滞培养试验组、体外对照组和体内对照组外，小鼠COCs分别于单独添加2.5μM Milrinone的培养液（Milrinone组）或添加25μM H89+50nM CNP的培养液（CNP+H89组）中预培养24h后再于常规成熟培养液中成熟培养16h.对结束培养的卵母细胞进行免疫荧光染色，统计具有正常MⅡ纺锤体形态的成熟卵母细胞的比率。结果显示，Milrinone组具有正常MⅡ纺锤体形态的成熟卵母细胞的比率为64.40±2.17%,显著高于体外对照组(54.73±2.37%)和CNP+H89组(15.89±1.80%)(P<0.05),但显著低于体内对照组卵母细胞(82.00±3.48%)和CNP阻滞培养试验组(76.03±2.46%)(P<0.05)。同时发现CNP+H89组成熟卵母细胞中具有正常MⅡ纺锤体形态的比率(15.89±1.80%)显著降低于其他各组(P<0.05).这些结果说明，CNP通过cAMP-PKA通路促进了小鼠卵母细胞成熟过程中正常纺锤体的形成。 (3)在上述研究工作基础上，进一步验证CNP通过cAMP-PKA通路促进了纺锤体组装相关的TPX2,KIF4mRNA的表达。采用qRT-PCR技术分别检测收集于PMSG处理24h和48h时不再体外培养的卵母细胞，以及50nM CNP阻滞24h,2.5μM Milrinone或25μM H89+50nM CNP处理24h后的卵母细胞中TPX2,KIF4mRNA的相对表达量。结果显示，与PMSG处理24h时不再培养的卵母细胞相比，50nM CNP阻滞24h显著提高了TPX2,KIF4mRNA的表达(P<0.05),并且与PMSG处理48h时不再培养的卵母细胞无显著差异(P>0.05).2.5μM Milrinone处理24h相对于PMSG处理24h时不再培养的卵母细胞中TPX2,KIF4mRNA的表达也显著提高了(P<0.05).使用25μM H89和50nM CNP共同处理24h相对于其他各组均显著降低了TPX2,KIF4mRNA的表达(P<0.05).这些结果显示，CNP通过维持高水平cAMP,进而通过cAMP-PKA通路促进了小鼠卵母细胞内纺锤体组装相关的TPX2,KIF4mRNA的表达。 综上所述，CNP通过cAMP-PKA通路促进了小鼠卵母细胞中纺锤体组装相关基因TPX2,KIF4mRNA的表达进而促进了正常MⅡ纺锤体的形成，提高了其成熟效果。