论文部分内容阅读
肿瘤是机体在各种致癌因素作用下,局部组织的细胞失去对生长的正常调控,导致其克隆性异常增生而形成的新生物,目前恶性肿瘤是危害人类健康最严重的一类疾病。肿瘤的发生是一个多因素、多阶段的过程,是在遗传因素、环境因素等诸多因素相互协同作用下,多种遗传及表观遗传学改变累积的结果,涉及多种癌基因的激活和/或抑癌基因的失活。尽管目前已有很多研究者对肿瘤进行了广泛深入的研究,也取得了不少成绩,但是肿瘤发生的分子机制目前仍然未能完全阐明。本研究拟从编码基因和非编码的小分子RNA角度来分析其在鼻咽癌和乳腺癌发生发展中的作用,从而为阐明肿瘤发生的分子机制提供理论基础,并为肿瘤的诊断、预后判断以及治疗提供潜在的分子靶标和策略。
第一章 miR-125b对乳腺癌细胞增殖、细胞周期的影响及其分子机制
研究背景及研究目的：
MicroRNA(miRNA)是一组小分子非编码RNA,可通过与靶基因mRNA的3-UTR结合调控基因的表达。miRNA可通过促进RNA降解、抑制mRNA转录和翻译调控靶基因。预测有1/3的编码基因受到miRNA的调控。越来越多的证据表明,miRNA的表达异常参与了多个生物学过程,如发育、细胞增殖、凋亡和分化。miRNA突变和表达异常在肿瘤发生发展的过程具有重要作用,提示miRNA可能充当癌基因或抑癌基因的角色。在我们的前期工作中发现miR-125b在乳腺癌中表达下调,本研究在此基础上对miR-125b的功能进行进一步探讨。
研究方法：
我们将miR-125b的前体转染乳腺癌细胞株MCF-7和MDA—MB-435,应用real—time PCR和荧光原位杂交的方法验证转染效率,应用MTT方法检测细胞增殖,低密度细胞集落形成实验检测细胞的克隆形成能力,应用流式细胞术分析转染后细胞周期的分布,利用microarray确定miR-125b调控的基因,荧光素酶报告系统进一步证实miR—125b的直接靶基因。
研究结果：
我们在乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-435细胞中过表达miR-125b,可以显著抑制细胞的增殖、克隆形成并引起细胞周期G1期增多,进一步进行表达谱分析和western blotting发现过表达miR—125b抑制MAN1B1、C9orf86、ETS1和MKNK2蛋白水平。荧光素酶报告实验也证实ETS1是miR-125b的直接靶基因。利用RNAi技术抑制ETS1的表达后同样可观察到细胞增殖的抑制、克隆数目减少以及细胞周期G1期增多,提示miR-125b可通过下调ETS1实现其抑制增殖、克隆形成以及影响细胞周期进程的功能。这些结果说明miR—125b在乳腺癌发生发展过程中充当一个重要的抑癌基因,可能为乳腺癌的治疗策略带来新的启示。
结论：
miR-125b通过抑制ETS1的表达抑制细胞增殖、诱导细胞周期G1增多,提示miR-125b在乳腺癌发生发展中的重要作用,可能在乳腺癌诊断、预后判断以及治疗中具有潜在的应用价值。
第二章 LATS2在鼻咽癌组织中的表达及其细胞生物学功能研究
研究背景及研究目的：
LATS2编码丝氨酸/苏氨酸激酶,在中心体复制和保持基因组稳定性具有重要的意义。近来有报道LATS2参与肿瘤发生过程。在乳腺癌和急性淋巴细胞白血病中,LATS2 mRNA表达下调。然而,LATS2在鼻咽癌中的表达及功能研究目前还没有报道,本研究以华南地区NPC人群为研究对象,分析LATS2的表达水平与鼻咽癌病人临床病理特征及预后的关系,并进一步深入探讨LATS2表达调控机制和生物学功能。
研究方法：
应用real-time PCR和免疫印迹的方法检测鼻咽癌细胞株和鼻咽上皮永生化细胞NP69细胞中LATS2的表达水平,应用免疫组织化学的方法检测220例鼻咽癌组织中LATS2蛋白的表达情况,并分析LATS2蛋白表达与病人临床病理特征及预后的关系,应用甲基化特异性PCR,我们检测LATS2基因启动子甲基化状态,应用RNA干扰技术在鼻咽癌细胞株5-8F和CNE2中转染siRNA抑制LATS2的表达。
研究结果：
在220个病例中,LATS2染色阳性的178例,阳性率80.91％(178/220),进一步分析显示LATS2表达水平与NPC病人临床病理特征无关,与预后有关,LATS2高表达的病人五年生存率(57.23％)显著低于LATS2低表达的病人(73.96％),Cox多重回归分析表明LATS2是鼻咽癌独立预后指标之一。甲基化特异性PCR检测显示30例鼻咽癌组织中11(36.7％)例表现为LATS2启动子甲基化,而23例鼻咽粘膜慢性炎组织均表现为LATS2启动子甲基化(100％),提示鼻咽癌组织中LATS2高表达可能是由于其启动子的去甲基化。进一步利用RNAi技术抑制LATS2表达,结果显示抑制LATS2表达可抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡以及细胞周期S期增多；在NP69细胞中过表达LATS2可促进细胞的增殖。
结论：
本研究的结果揭示了LATS2在促进细胞增殖以及鼻咽癌发生中的重要作用,转染小分子siRNA特异性抑制LATS2的表达可以抑制增殖、诱导凋亡和细胞周期S期增多,提示LATS2在鼻咽癌防治中具有潜在的应用价值。