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肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其死亡率位居恶性肿瘤的第三位[1]。肿瘤治疗失败导致高死亡率的根本原因是转移、耐药和复发[2]。近年来的研究证明肿瘤干细胞在恶性肿瘤的转移、复发及耐药中发挥重要作用[3-4]。因此,靶向肿瘤干细胞的治疗新策略,有望降低肿瘤转移、复发及耐药,提高疗效,降低死亡率。本研究首先选择转移能力不同的2株肝癌细胞系Be17402-V3和HepG2,采用无血清悬浮成球培养(sphere培养)具有自我更新能力的肿瘤干细胞。应用流式免疫荧光和细胞免疫荧光技术检测了PKH26、ESA、CD44、CD133、CD117等12种干细胞标志物,结果发现在Be17402-V3肝癌细胞系中ESA+和CD44+两种表型的细胞在sphere培养细胞中被明显富集,表明他们可能是肝癌干细胞。在HepG2细胞中,只有CD117+细胞可能是肝癌干细胞。采用流式荧光分选技术从2株肝癌细胞系中分别分选ESA+、CD44+及CD117+细胞经体外sphere培养,侵袭能力和耐药性测定以及裸鼠体内致瘤性检测等研究,发现ESA+细胞具有肿瘤干细胞自我更新能力、高侵袭性、高耐药性和在裸鼠体内高致瘤性的特征,是肝癌细胞系Be17402-V3中的肝癌干细胞,ESA是肝癌干细胞的标志物之一。用同样的技术首次在细胞系HepG2中也证明CD117+细胞是肝癌干细胞,CD117是肝癌干细胞的标志物之一。至此,我们成功地建立了肝癌干细胞的体内成瘤细胞模型,为研究抗人肝癌干细胞抗体奠定了重要基础。在成功建立肝癌干细胞的细胞模型及体内成瘤模型的基础上,我们对前期筛选获得的抗人肝癌干细胞的2株单抗15D2和15B7进行了生物学特性及单抗靶向肝癌干细胞治疗肝癌的体内实验研究。首先采用双色免疫荧光及双色流式荧光检测的结果发现,15D2单抗能与肝癌干细胞标志物ESA、PKH26共染,表明该抗体识别的是肝癌干细胞。流式分选获得的15D2+细胞经体外sphere培养、侵袭性、耐药性及体内致瘤性检测分析,发现15D2+细胞与15D2细胞比较,具有高度自我更新、高耐药性和裸鼠体内高致瘤性的肿瘤干细胞特征,证明15D2单抗是抗肝癌干细胞的特异性单抗。体外功能研究结果显示,15D2单抗能显著抑制肝癌干细胞的增殖和迁移侵袭功能.抑制率分别达41.7%、35%和11.9%,表明15D2单抗是抗人肝癌干细胞的功能性抗体。15D2单抗靶向肝癌干细胞治疗肝癌的动物体内实验研究结果显示,接种肿瘤细胞2个月,停药1个月时,高、中、低剂量的15D2单抗治疗组抑制肝癌生长的抑制率分别为82.6%、71.4%和60%,单抗高剂量联合化疗药顺铂治疗的抑制率为91%,但单用化疗药顺铂的抑制率为56.7%,而且近3周单用化疗组肿瘤生长加快,显示肿瘤复发,这些结果表明抗肝癌干细胞单抗高剂量联合化疗组治疗效果显著优于单用化疗药,并略优于单用抗体组,表明15D2单抗靶向肝癌干细胞,不仅能明显抑制肿瘤生长,而且还能治疗肿瘤的复发和耐药,这些结果让我们看到靶向肿瘤干细胞治疗有望通过抑制肿瘤复发转移,突破耐药而减少死亡率延长生存期的希望。采用同样的技术路线和方法,我们也证明了抗人肝癌干细胞单抗15B7是抑制识别人肝癌干细胞的单抗,15B7+细胞具有肝癌干细胞的高度自我更新、高侵袭等肿瘤干细胞的特征。体外功能研究也证明,15B7单抗能显著抑制肝癌干细胞的sphere增殖及成球生长,其抑制率分别达50.3%和32.4%抑制迁移侵袭的抑制率达7.8%,表明15B7单抗也是一株抗人肝癌干细胞的功能性单抗。