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丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)是丙酮酸脱氢酶复合体的负调控酶,在呼吸作用中起着重要的调节作用。水稻的PDK有两种同工酶,分别是PDK1和PDK2。OsPDK1位于水稻基因组的第七条染色体上,其cDNA全长为1498bp,编码有363个氨基酸残基的多肽链,OsPDK1主要在叶片中表达。本研究试图探讨OsPDK1在蛋白水平上的表达模式,主要取得以下结果:
1.成功克隆OsPDK1基因,成功把目的片段插入到载体pET—23d并转化到表达菌株B121(DE3)中。
2.目的片段在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,经过纯化得到较纯的重组蛋白,然后免疫新西兰白兔成功制备OsPDK1多克隆抗体。
3.通过Western—blot分析,水稻PDK1基因的表达存在昼夜节律变化,在一天的上午10点到下午16点PDK1基因维持比较高的表达量,而其余时间则处于低表达水平。激素对PDK1的表达也有一定的影响:GA能上调PDK1的表达,PP333则不影响PDK1的表达。
4.提取水稻叶片线粒体,制备PDC粗酶,通过测定PDC的活力,发现PDC活力变化也存在昼夜节律变化。昼夜24小时内,PDC活力变化较大,活力较大的时间表现在晚上23点到次日3点,其活力范围在0.360~0.680酶活力单位,活力较小的时间表现在白天的12点到15点,其活力范围在0.140~0.240酶活力单位。
5.PDK1基因的昼夜节律表达Western—blot分析结果与PDC活力测定结果相符合,PDK1高水平表达时PDC活力低,PDK1低水平表达时PDC活力高,证明PDK1负调控PDC。