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合成生物学是生物学领域近几年兴起的一种重要研究手段,也是将多学科研究方法相结合而产生的前沿学科。它是以人工设计和构建核心元件为主要思路,将其合理组合优化,形成工程化、标准化、可替换的功能模块,合成诸如酶分子、基因环路、生命形态等。合成生物学中的元件被赋予工程学上的模块化性质,可以在更大规模的设计中进行组合从而实现更大规模的生物工程学改造。目前,合成生物学这一研究方法已在生物医药、生物能源、生命合成等方面取得许多重要进展。亚铁血红素是生物体内卟啉化合物的一种重要形式,由原卟啉IX中的四个吡咯环与Fe2+螯合而成,在生物体正常代谢过程中发挥着重要的功能,在大肠杆菌中血红素是由重要的中间产物5-氨基乙酰丙酸(ALA)转化而来。ALA是大肠杆菌中所有吡咯化合物的前体物质,在医学和农业等领域都具有非常广阔的应用前景,目前对微生物代谢改造生产ALA的研究得到普遍关注。在这一途径中,血红素一方面参与呼吸过程影响大肠杆菌中心代谢,另一方面它的合成偶联呼吸电子传递链产生能量,从而影响大肠杆菌能量产生方式以及代谢流的分配。本实验室在改造代谢途径积累ALA的课题研究发现,ALA作为光敏感的中间产物,其积累受到上下游基因共同影响,单纯过表达某些上游基因或弱化下游基因往往得不到较好的效果,并且血红素作为该路径上的终产物经常会在胞内过剩积累,这样不仅会造成能量的浪费,并且会影响ALA积累。因此,针对这一问题,动态调节细胞内血红素水平显得尤为重要。本研究从这一点出发,利用合成生物学思路和方法,结合代谢工程的研究背景,构建了一个含IRRrl-Pice和CI-Pci两个阻遏元件和带有降解标签的gfp-ssrA报告基因组成的动态感应血红素调控相关基因表达的调控组件。本研究选取的感应血红素的关键蛋白是从豆科根瘤菌中找到的IRRrl蛋白,同时引入来自λ噬菌体的负调控元件CI-Pci,以及在报告基因后面加入恒定讲解标签ssrA以减少构建过程中菌体的表达压力。在正常情况下,IRRrl蛋白可以与Pice启动子上的ICE序列结合阻遏后面基因转录。在胞内血红素含量较高时,IRRrl蛋白可以与血红素结合改变自身构象,Pice激活下游CI蛋白转录,CI蛋白表达与Pci启动子结合发挥阻遏效应,报告基因gfp-ssrA转录关闭；当血红素水平较低时,血红素执行自身功能不与IRRrl蛋白结合,Pci启动子不受抑制,报告基因得以表达。若将此处的报告基因换成血红素合成途径上游的基因,便可根据血红素浓度高低动态调控基因转录,进而提高中间产物ALA的积累。本研究进一步对构建的动态感应血红素元件进行验证,通过分析单个启动子的启动功能、单个及串联元件的开关效果,亚铁离子对于开关的影响,验证了调控元件对于铁离子浓度的感应效果以及与胞内血红素结合后对基因转录的调整变化。具体包括：首先以DH5a菌株为背景验证单个启动子功能,分别将Pci和Pice启动子同gfp-ssrA组装到pUC19质粒骨架上,构建了质粒pGFPⅠ和pGFPⅡ,在16h内荧光持续积累,单位OD荧光值呈上升趋势,说明外源的Pci和Pice启动子可以在大肠杆菌中很好地启动报告基因转录。其次验证单个元件的功能,构建了质粒pGFPⅢI和pGFPIV由于lac启动子关闭不严,在DH5a菌株中诱导阻遏蛋白后没有出现足额现象。实验发现在培养基中添加一定浓度的葡萄糖,或者将背景菌株更换为来源于菌株MC1061的TOP10菌株,均可以抑制lac启动子泄露,从而使开关效应更加严谨、灵敏。之后构建了质粒GFPⅢ2和pGFPⅣ2,摇瓶发酵曲线上看表达阻遏蛋白后5h左右可以明显出现抑制启动子转录现象。最后,将两个负调控元件串联,构建了质粒pGFPV,并转入实验室构建的胞内血红素积累较多的DHGAL菌株中,元件在血红素含量较高时关闭报告基因gfp-ssrA的转录,随着菌体生长,单位OD菌体荧光值下降。本实验成功构建了合成生物动态元件,能够通过感应大肠杆菌内血红素水平调控基因转录,为血红素生成途径上的代谢改造特别是重要中间产物的合成提供了一个新的策略。