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目的:现代社会随着科学技术的发展,临床诊断和治疗手段的提高,在广大肺癌患者中,很多病人都能够在早期发现,并且进行有效的治疗,临床治愈率不断提高。但是随着癌症的复发和转移,死亡人数仍然居高不下。虽然说局限性原发性肺癌通过手术切除和辅助性化疗可以治愈,但是复发和转移性肺癌的不可根治性依然是当今医学的重大难题。现阶段根据广大学者提出的癌干细胞（cancer stem cells,CSC）学说,认为CSC是癌细胞增殖的基础也是导致癌症复发和转移的重要原因。现已证实在多种癌症中都有癌干细胞的存在,但其特性的调控机制仍所知有限。如能解释和阐明癌干细胞的调控机制,则可能对未来的癌症治疗效果上带来革命性的突破。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-Fu）是恶性肿瘤化疗的基础用药,广泛应用于临床治疗。它在临床上属于针对恶性肿瘤的细胞周期特异性药,主要作用于S期,许多的化疗方案都含氟尿嘧啶类药物。我们的研究组发现5-Fu富集的耐受化疗的癌细胞具备诸多为癌干细胞特性。本研究以人肺腺癌A549细胞系为实验对象,应用无血清培养以及5-Fu作用富集癌干细胞,通过观察干细胞相关因子Oct3/4表达的动态变化,来探讨Fbxw7与Skp2是如何调控癌干细胞进出G0/G1期的机制。然后通过分别转染Fbxw7与Skp2来进一步证明两者对各自的泛素化底物c-Myc和P27的调控作用。进一步探讨Fbxw7和Skp2基因对A549癌干细胞由G0/G1期向S期转化即A549细胞癌干细胞休眠与激活的调控机制。研究方法:1、免疫组织化学染色检测Fbxw7与Skp2在肺腺癌组织中的表达。2、10%胎牛血清的RPMI-1640、100U/ml的青霉素、100U/ml链霉素的培养液,培养条件为37℃、含5%CO2的细胞培养箱内进行进行A549细胞培养。3、MTT法测定5-Fu对A549细胞增殖的半数抑制率。4、依照5-Fu（IC50）作用A549细胞,以作用前、作用后恢复0h、48h为时间点构建A549细胞5-Fu打击恢复细胞模型。5、免疫荧光染色检测Fbxw7、c-Myc、Skp2、P27以及Oct3/4基因在A549细胞5-Fu打击恢复后细胞模型中的表达。6、无血清培养法培养A549细胞,收集悬浮的A549癌干细胞球。7、分别建立瞬时转染下调的Fbxw7和Skp2的siRNA干扰A549细胞系。8、Western blot检测Fbxw7、c-Myc、Skp2、P27及Oct3/4基因蛋白水平的表达。9、Real-time PCR技术检测Fbxw7、c-Myc、Skp2、P27及Oct3/4基因mRNA水平的表达。10、流式细胞仪检测细胞周期变化。11、建立A549腺癌细胞株的裸鼠皮下移植瘤实验。12、实验结果以3次独立实验为基础,用均值±标准差（mean±SD）表示。用SPSS软件进行分析。当有统计学意义P<0.05时采用。结果:1、Fbxw7在肺腺癌中阴性表达,在癌旁组织中阳性表达,表达趋势与细胞分化程度正相关。Skp2在肺腺癌中阳性表达,在癌旁组织中阴性表达,表达趋势与细胞分化程度负相关。2、5-Fu能抑制肺癌A549细胞的增殖,通过MTT法检测细胞增殖抑制率发现这种抑制与药物浓度和作用时间呈正相关。根据MTT检测结果,本实验最终选定200μg/ml、作用24小时作为5-Fu对A549细胞的半数抑制量（IC50）来进行实验。3、无血清培养和5-Fu作用可富集A549细胞的癌干细胞。通过对无血清培养收集的悬浮干细胞球,以及对5-Fu（IC50）作用前后A549细胞进行干细胞相关因子Oct3/4检测发现,5-Fu（IC50）作用前与无血清培养前Oct3/4基本上都不表达,5-Fu作用后以及无血清培养后Oct3/4表达阳性细胞明显增多。4、免疫荧光双染色法分别将5-Fu（IC50）作用前后Fbxw7、c-Myc、Skp2、P27与Oct3/4进行双染,发现在5-Fu（IC50）作用后,当Oct3/4表达增多时,Fbxw7与P27表达增多;c-Myc与Skp2表达减少。5、Fbxw7、c-Myc、Skp2与P27与A549细胞周期调控相关。利用5-Fu（IC50）作用前,作用后恢复0h,恢复48h构建A549细胞打击恢复的模型。通过生物学检测发现,Fbxw7与c-Myc表达变化趋势相反;Skp2与P27表达变化趋势相反。细胞周期检测结果显示,5-Fu（IC50）作用后恢复0h与5-Fu（IC50）作用前相比,G0/G1期的细胞比例明显增多,S期的细胞比例则减少;与恢复至48h组相比较,恢复0h组的G0/G1期细胞比例显著减少,S期细胞比例明显增多。可以得出Fbxw7、c-Myc、Skp2、P27参与并调控A549细胞系癌干细胞的休眠与激活。6、应用SiRNA干扰技术分别瞬时沉默Fbxw7和Skp2后,发现Fbxw7通过负向调节c-Myc的表达,能将A549的癌干细胞稳定在G0/G1期。Skp2通过负向调节P27的表达,促使A549的癌细胞进入到S期。此结果在动物实验中也得到了验证。结论:1、Fbxw7的表达与细胞分化程度呈正相关。Skp2的表达与细胞分化程度呈负相关。2、Fbxw7通过负向调节c-Myc的表达,能够阻碍A549细胞癌干细胞由休眠期向增殖期转化,即Fbxw7有稳定癌干细胞休眠的作用。Skp2通过负向调节P27的表达,使癌干细胞激活。3、抑制Fbxw7可以将癌干细胞先赶入增殖期,令其更易于被抗癌药杀灭,为减少和杀灭癌干细胞提供了新的途径。4、抑制Skp2能够抑制癌干细胞的激活,可以有效阻碍肿瘤细胞的增殖和分裂,为长期维持人癌共存,延长患者的生存年限提供了基础理论依据。