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环酰亚胺水解酶(cyclic imide hydrolase，CIH，EC.3.5.2.16)是环酰胺酶（包括海因酶、二氢尿嘧啶酶、二氢乳清酸酶、尿囊素酶等）中的一个亚类，也称酰亚胺酶(imidase)。广泛分布于细菌、真菌和霉菌中。它参与细菌体内的环酰亚胺代谢，催化底物打开环酰胺键，生成相应的半酰胺，最终进入类似于TCA的代谢途径。Imidase是生产非天然的氨基酸、丙酮酸以及3-氨基甲酰-α-吡啶酸等有机酸的重要工业酶，受到了人们的广泛关注。 锌离子是生物体内的一种重要的二价金属离子，也是很多金属酶及转录因子的辅因子，它不仅可以稳定蛋白的结构，也可以直接参与酶分子的催化。利用PAR与假单胞杆菌YZ-26来源的imidase竞争锌离子实验，显示PAR的浓度达到1mM时，imidase的剩余活力仅为16.6％，计算imidase的锌离子的结合常数为9.5×108M-1。为了研究imidase的锌离子结合位点，依据其同源建模结果，构建了一系列重组质粒pMAL-s-cih247、 pMAL-s-cih7,108、pMAL-s-cih7、pMAL-s-cih108、pMAL-s-cih86、pMAL-s-cih151，并转入BL21(DE3)中，经终浓度为0.25mM的IPTG诱导后，37℃诱导培养3～5h后均为可溶性表达。酶活性分析揭示:突变酶H247/A、CC7,108/GG、C7/G、H86/A基本没有活性，C108/G保留了72％的酶活，而H151/G的活性相对于天然酶提高了约20％。菌体经超声破碎、Amylose亲和层析、ProScission Protease切割、硫酸铵沉淀及Sephacryl S-200凝胶层析获得电泳纯的蛋白。 利用PAR的竞争实验，比较了不同imidase突变体蛋白的锌离子结合特征，揭示H247/A、H86/A、CC7,108/GG较野生型imidase竞争锌离子的能力明显降低，而突变体H151/G与PAR竞争锌离子的能力却略有提高。结合酶活性测定结果推测His86，His247和Cys7，108可能与锌离子的结合及imidase的催化活性密切相关。进一步对突变体的CD谱分析和对野生型imidase的晶体解析，肯定了His86、His90与Asp14为锌离子的结合位点，而His247与Tyr23是与底物结合的关键残基。 半胱氨酸残基通常可以结合金属离子或作为酶的活性位点，还可通过形成二硫键在蛋白质结构和功能上发挥重要作用。对imidase中仅有的两个半胱氨酸残基的巯基基团进行DTNB修饰，并结合还原性及非还原性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，揭示了天然状态下，imidase中的两个半胱氨酸残基以游离形式存在，不形成链内及链间二硫键。进一步酶的聚合状态和锌离子结合实验显示:C108/G与野生型imidase相同，为具催化活性的四聚体结构且具有一定的锌离子结合能力;C7,108/G为多聚体状态，C7/G是单体和聚体的混合物，它们不再具有催化活性且不能结合锌离子。可以推断Cys7是维持酶分子构象的关键残基。