论文部分内容阅读
白菜种皮颜色是十字花科芸薹属作物一个重要的园艺性状，根据种皮颜色的不同可以将芸薹属作物的种子分为黄色种子和棕色种子两大类。相比于棕籽，黄籽生产的油及膳食质量更高，不仅如此，黄籽含油量更高，生产的油更清亮，粗纤维含量更低，蛋白质含量更高，并且菜籽残渣对喂养动物具有更好的饲养价值。从芸薹属作物起源来讲，白菜是甘蓝型油菜和芥菜型油菜的原始亲本之一，是我国主要的蔬菜作物和油料作物，因此对于白菜黄籽的研究和黄籽油菜品种的选育具有重大的意义。本研究选取大白菜棕籽纯系‘92S105’、黄籽纯系‘91-125’及其杂交获得的F1代、F1代单株自交获得F2代分离群体以及F3代棕籽纯系B147和黄籽纯系B80为研究材料，对种皮颜色基因进行精细定位，鉴定了控制种皮颜色的候选基因，克隆并分析了候选基因序列差异及基因表达差异，同时选取合适发育时期的种子进行了转录组测序和类黄酮成分分析，综合分析了黄色种皮颜色形成的原因。取得了以下主要的结果： 1. 根据对棕籽纯系‘92S105’和黄籽纯系‘91-125’杂交获得的F2代分离群体单株种皮颜色调查分析，结果表明白菜种皮黄色性状是由单基因控制，且黄籽性状对棕籽性状为隐性遗传。 2. 使用BSA法结合SSR分子标记对种皮颜色进行基因定位，定位群体为1575个单株的F2代分离群体，精细遗传图谱显示距离种皮颜色基因Brsc-ye最近的两个标记为SSR449a和SSR317，距离Brsc-ye的遗传距离分别为0.07 cM和0.06 cM，这两个侧翼标记将Brsc-ye基因定位在40.2 kb的物理区间内。通过对两个亲本材料DNA的重测序，分析比较其在40.2 kb物理区间内的变异，确定控制种皮颜色的候选基因为BrTTG1；序列分析发现黄籽BrTTG1中有94bp的碱基缺失，导致黄籽BrTTG1的基因序列全长仅为300bp，预测的蛋白质序列全长仅含有99个氨基酸，且不含有WD40结构；根据BrTTG1序列在棕籽和黄籽中的不同，开发出了一个与种皮颜色共分离的SSR标记Brsc-yettg1，该标记可用于种皮颜色的早期鉴定选择。 3. 选取F3代自交亲和的棕籽纯系B147和黄籽纯系B80花期的不同组织（根、短缩茎、莲座叶、叶脉、花茎、茎生叶、花和花蕾）和不同发育时期的种子（花期授粉后8 d、10 d、12 d、14 d、16 d、18 d、20 d、22 d、24 d、26 d、28 d、30 d、32 d和34 d）为研究材料，检测了BrTTG1基因的表达水平，结果显示，在不同组织中，BrTTG1基因均有表达，而且BrTTG1在棕籽材料各个组织中的表达均高于黄籽材料；在不同发育时期的种子中，BrTTG1 mRNA的转录水平整体呈现波浪形，且在B147中的转录水平始终高于在B80中的转录水平。 4. 以B147和B80不同发育时期的种子为试材，对其种皮原花青素进行DMACA染色，发现在棕籽B147中，原花青素在发育第14 d的种子中开始积累，且积累量随着种子的成熟越来越多，而黄籽B80所有时期的种子中几乎无明显的原花青素的积累。根据DMACA染色后种皮颜色的变化，我们选择开花后第10 d、14 d和28 d的种子进行组织切片TBO染色观察，结果显示在B147中，类黄酮类物质从种脐处开始积累，并逐渐延伸到色素层和栅栏组织中，而在B80中，类黄酮类物质主要在种脐处积累，色素层和栅栏组织中积累量很少。 5. 通过LC-MS/MS对B147和B80开花后第10 d、14 d、28 d和34 d种子中类黄酮类物质成分进行分析，共发现了31种类黄酮类物质。其中10种物质仅在B147种子中检测到，包括表儿茶素及其衍生物、原花青素二聚体和一些槲皮素衍生物，其中表儿茶素及其衍生物和原花青素二聚体在B80种子中始终都没有检测到；在B147第14 d以后的种子中检测到了原花青素，这与种皮DMACA染色结果一致，说明原花青素是棕色种皮颜色形成的主要物质；槲皮素、山萘酚及其衍生物在B147和B80种子中没有明显的含量差异，因此推测槲皮素和山萘酚及其衍生物在种皮颜色差异形成过程中作用并不显著。 6. 对B147和B80开花后第10 d、14 d和28 d种子进行了RNA-seq分析，结果显示在黄籽B80种子中，类黄酮生物合成途径中的早期生物合成基因均表现为下调表达，而晚期生物合成基因几乎不表达。参与原花青素生物调控的MYB-bHLH-WDR复合体中的4个转录因子（TT2、EGL3、TT8和MYB5）中TT2和EGL3在B147和B80相同时期的种子中转录水平无明显变化，而TT8和MYB5在B147和B80相同时期的种子中转录水平差异显著，说明B80中TTG1的突变不仅影响了类黄酮生物合成途径中结构基因的转录水平，还影响了TT8和MYB5转录因子的转录水平。 综合种皮颜色候选基因的鉴定、LC-MS/MS及RNA-seq分析结果，可以看出TTG1的突变是影响种皮颜色由棕色变为黄色的根本原因。黄籽中TTG1的突变导致其蛋白序列中WD40结构的缺失，因此不能形成MBW三元复合体，使类黄酮生物合成途径紊乱，表现为中上游基因的转录水平降低、下游基因几乎不转录，同时使TT8和MYB5转录因子的转录水平降低，导致无法合成原花青素的单体表儿茶素，最终形成黄籽。