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目的：
Zr61Ti2Cu25Al12金属玻璃（以下简称ZT1），是中科院金属研究所自主研发的一种新型Zr基BMG，相对于目前临床上常用的牙科种植体材料CP-Ti、Ti6-Al-4V合金，ZT1的力学性能有了很大的改进:它的杨氏模量(E=83GPa)，降低了约20％，更接近皮质骨，可以有效减少“应力遮挡”效应的发生;它的断裂韧性(KJIC=130MPa√m)较高，能够承载很大的咬合力;它的弹性极限约2％，对咬合力有更好的缓冲作用。因此我们认为ZT1是更具优势的牙科种植体材料。
Zr基BMG由于具有出色的机械性能和良好的生物相容性，使它在医学领域越来越受到关注。现有文献中把它作为生物材料，主要是应用于临床上的外科手术中，譬如人工髋关节置换术、心血管支架术和骨折固定术等，相关研究结果也支持其应用。Zr基BMG的制作与生产工艺也完全符合种植体的要求，它的理化性能及生物学性能也都能满足牙科种植体的需要。Zr基BMG较高的屈服强度和相对较低的密度[1,2]导致高强度/重量比例，使得种植体可以设计成很小的几何形状，从而减少植入过程中造成的组织损伤;还具有独特的成形性高的加工性能:由于在凝固过程中缺乏第一阶相变，使BMG的收缩率比传统铸造合金减少了一个数量级，从而能达到更高的铸造精度[3]，因此，BMG在设计制作过程中，可以精确地控制其表面纹理。另外Zr基BMG作为种植体还有一个显著优势一具有MRI成像的优越性，而目前的种植体材料如钴铬合金和316W不锈钢等在MRI成像时会造成图像扭曲和模糊，影响头颈部MRI的检测结果。因此我们认为，Zr基BMG更适合应用到口腔种植术中，作为正常的牙科种植体和矫形的迷你种植体使用。
本研究根据牙科种植体的应用特点及环境因素，将ZT1的生物相容性与目前临床上最常用的3种牙科种植体材料(CP-Ti、Ti6-Al-4V和ZrO2)作了较为全面的对比。在体外将5种细胞（L929、HU、MG63、hMSCs和HUXMA-01101细胞）分别接种于样品表面，一定时间段后进行SEM、免疫荧光染色、CCK-8和Real-timeRT-PCR检测，综合地评价ZT1对细胞的粘附、增殖和分化过程的影响;在体内通过口腔黏膜刺激试验，将样品缝制在金黄地鼠颊囊内，观察一定时间段后取受试区颊粘膜组织切片，HE染色，同时进行血常规检测，评价ZT1对口腔粘膜的刺激性和对血液的影响。旨在为ZT1作为新型牙科种植体材料提供基础研究。
材料与方法：
1、材料制备
(1) ZT1、CP-Ti、Ti64合金（医用级）和ZrO2（爱尔创）制备成直径6mm、厚度2mm的圆片。(2) ZT1，CP-Ti（医用级），工业用聚氯乙烯（PVC，上海化工厂生产）。将其制备成直径5.0mm，厚0.5mm的圆片各22个，保证表面光滑，边缘圆钝，圆片中央制备二个等距小孔（类似纽扣），以便缝线穿过。所有样品用碳化硅砂纸打磨到1200号，然后抛光膏抛光至镜面。无水乙醇浸泡1h，超净工作台中紫外线照射正反两面各1h，备用。
2、细胞培养
(1)复苏后的L929、HU和MG63细胞加入培养基;(2)复苏后的hMSCs和HUXMA-01101细胞加入培养基，在37℃，5％CO2及饱和湿度条件下静置培养，倒置显微镜下观察细胞生长情况，2-3天换液，细胞长至80％融合时，进行传代。
3、实验材料分组
(1)论文一:实验组:ZT1;对照组:CP-Ti，Ti64;阴性对照组为空白对照。
(2)论文二:实验组:ZT1;对照组:CP-Ti，Ti64，ZrO2。
(3)论文三:对照组:ZT1;阴性对照组:CP-Ti;阳性对照组:PVC。
4、SEM形态学观察
(1)取1块无菌96孔板，将消毒后的ZT1、CP-Ti和Ti643种样品放入孔中，以2×104/ml的密度将L929、HU和MG63细胞分别接种其上，分别于接种后2h、4h、6h取出，4％多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，样本喷金。每个样品每个时间点重复5次。
(2)取1块无菌12孔板，将消毒后的ZT1、CP-Ti、Ti64和ZrO24种样品放入孔中，以2×103/ml的密度将hMSCs细胞接种其上，2h和6h后取出，4％多聚甲醛固定，CO2临界点干燥，样本喷金。每个样品每个时间点重复5次。
SEM采集图像。
5、CCK-8检测
细胞及接种方法同5(1)，分别于(1)接种后4h、1d、2d、3d和5d取出;(2)接种后4h、1d、2d、3d、5d、7d、10d和14d取出。吸弃原培养液，将样品移入新的96孔板中，每孔加入培养液和CCK-8混合液，孵育1h后，避光条件下每孔取出溶液放入新的96孔板中，450nm波长条件下酶标仪检测OD值。每个样品每个时间点重复5次。
6、荧光显微镜形态学观察
(1) HUXMA-01101细胞接种方法同5(2)，2h和5h后取出，4％多聚甲醛固定。每个样品每个时间点重复5次。
(2) hMSCs细胞接种方法同5(2)，细胞生长融合至50％，固定，封闭，一抗孵育，二抗孵育，F-actin和细胞核DAPI染色，封片。每个样品每个时间点重复5次。
荧光显微镜采集图像。
7、Real Time RT-PCR法检测
(1) MG63细胞接种方法同5(1)，接种后4h、1d、4d、7d和14d取出;(2)HU细胞接种方法同上，接种后1d、4d和7d取出。吸弃原培养液，将样品移入新的96孔板中，0.25％胰酶消化后收集细胞，-80℃保存。样本总RNA提取，反转录，得到对应的cDNA，电泳分析，Exicycler TM96荧光定量仪检测(1)MG63细胞内整合素β、ALP、COL I和骨钙素，(2) HU细胞内血VEGF和VWF的基因表达情况。
8、口腔黏膜刺激试验
选择出生60～70d的雄性金黄地鼠66只平均分成3组，全麻下，用无损伤缝合针线将样品缝合到金黄地鼠右侧颊囊黏膜上，与黏膜紧密贴合但无压迫，贯通黏膜皮肤全层，另一侧作为空白对照组。术后2w、3w和4w处死，拆线，取出试样，样品SEM观察有无点蚀发生，粘膜组织HE染色，光镜观察。
9、血液分析
实验8中的金黄地鼠处死前腹主动脉取血3ml，血常规检测。
10、统计学分析
CCK-8所测得的OD值用(x)±s表示。单因素方差(One way ANOVA)分析Real-time RT-PCR所得的结果，单因素方差加配对t检验法分析血常规指标统计。使用SPSS14.0软件进行统计学分析。所有的检测数据，至少重复3次，p＜0.05被认为有统计学意义。
实验结果：
1、SEM形态学观察
(1) L929、HU和MG63细胞接种在样品表面后，呈现出各个细胞特征性的形态，贴附紧密，表面清晰可见蛋白和伪足，生长状态良好。3种材料上细胞的数量和形态未见差别。
(2) hMSCs细胞接种在样品表面后，呈长梭形或多角形，贴附紧密，表面清晰可见蛋白和伪足，生长状态良好。4种材料上细胞的数量和形态未见差别。
2、CCK-8检测
(1)3种细胞在接种的初期(≤3d)，在3种样品表面的增殖情况没有稳定的趋势，随着时间的延长，在5d时ZT1的OD值明显高于CP-Ti和Ti64，而后两者间则一直没有差别。
(2)3种细胞在接种的初期(≤5d)，在3种样品表面的增殖情况没有稳定的趋势，但是随着时间的延长，从7d开始直14d，ZT1的OD值明显高于CP-Ti和Ti64，而后两者间则一直没有差别。空白对照组在7d时达到增殖高峰，之后逐渐下降。
3、荧光显微镜形态学观察
(1) HUXMA-01101细胞接种后，在材料表面均匀分布，覆盖大约80％以上的表面积。贴附良好，2h时多数细胞呈圆形或卵圆形，6h时多数细胞呈长梭形或多边形。4种材料样品表面细胞的数量和形态没有差别。
(2)hMSCs细胞接种6h后，细胞骨架F-actin和核DAPI荧光显微镜下可见，F-actin呈红色，肌丝排列有序，细胞骨架轮廓清晰。细胞核呈蓝色，卵圆形，核膜连续完整，大致位于细胞中央。4种材料样品表面细胞的数量和形态没有差别。
4、Real Time RT-PCR法检测
(1)粘附初期，贴附在ZT1表面的MG63细胞分泌的整合素β的mRNA的量明显高于CP-Ti和Ti64的;随着时间的延长，特征性的成骨细胞因子ALP、COL I和骨钙素的mRNA的量也明显高于CP-Ti和Ti64的。
(2)贴附在ZT1表面的HU细胞分泌的VWF和VEGF的mRNA的量，在1d时明显高于CP-Ti和Ti64的，但低于空白对照组;在4d时，降低，与后两者间有不明显差异;在7d时重新增高，明显高于CP-Ti和Ti64的。
5、颊粘膜的HE染色
ZT1组的与CP-Ti组相近，光镜下可见颊囊黏膜上皮完整，无异常增生，细胞层次清楚，排列整齐。缝合2w时这两组均有小血管增生，充血，结缔组织内有少量炎症细胞浸润;3w时血管增生几乎停止，4w时仅在结缔组织内有少量炎症细胞浸润。而PVC组则呈现出典型的炎症反应。
6、样品在口腔中的腐蚀情况
肉眼和光学显微镜下均未见到ZT1和CP-Ti两种材料表面有点蚀发生。
7、血液分析
2w时血常规指标检测所得的WBC、Mon、Mon％、Lymp、Neu等指标3个实验组的值都高于正常值，3w和4w时，上述指标回复正常范围内;同时RBC、PLT、HGB、HCT％等指标3个实验组的值没有差别均高于正常值。
结论：
1、接种在ZT1表面的L929、HU和MG63细胞的粘附、增殖和分化情况要优于CP-Ti和Ti64。
2、与CP-Ti、Ti64和ZrO2相比，接种在ZT1表面的hMSCs和HUXMA-01101细胞的粘附情况良好，各组间没有明显差别。
3、口腔黏膜刺激试验中，颊粘膜的HE染色图片的观察结果与血常规的检测结果中炎性指标的增高相对应，说明样品的缝入对鼠的机体来说是个应激反应。ZT1组的数据与CP-Ti组的基本上没有差别，说明他们的生物相容性无明显差异。