论文部分内容阅读
三斑海马是一种海洋硬骨鱼,是包括中国在内亚洲国家的名贵药材,也是海南热带地区特色资源。海马富含生理活性成分,目前已有很多关于其药理活性的研究,例如抗肿瘤、抗氧化、延缓衰老等功效。本研究以三斑海马为研究对象,首先经95%乙醇回流提取获得小分子醇提物,再经系统溶剂萃取依次获得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水的提取物。采用硅胶柱层析对石油醚提取物进行分离,经过不同极性溶剂洗脱获得抗炎活性组分。分别检测不同组分对抑制脂多糖刺激体外培养小鼠单核巨噬细胞RAW264.7炎症介质和炎症因子的产量评价其抗炎活性。并用分离得到的糖脂为原料制备鞘糖脂和长链碱,采用K562和HepG2肿瘤细胞来评价其抗肿瘤活性。另外,采用葡聚糖凝胶G-10对水提取物分离组分进行过滤层析,并测定不同分离组分的抗氧化活性。本研究为进一步研究三斑海马生理活性作用提供参考及理论依据,以期提高三斑海马在功能性食品和医药上的应用价值。本文研究内容和结果如下:1.三斑海马抗炎活性成分的分离及体外生理活性评价本文建立脂多糖刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7体外细胞炎症反应模型,以抑制炎症介质一氧化氮产生能力作为三斑海马抗炎活性的筛选指标。以三斑海马干燥体为原料,经粉碎后过20目筛,再经95%乙醇回流提取获得小分子醇提物,其经过系统溶剂萃取,获得不同极性组分。其中石油醚组分为脂溶性组分,经过硅胶柱层析,用石油醚和乙醇等度/线性混合洗脱,获得四个不同极性洗脱组分。其中洗脱组分FrⅣ先后经过水洗和盐洗后获得脂质组分,再根据极性差异,采用硅胶柱层析,分别用氯仿、丙酮和甲醇依次洗脱获得中性脂、糖脂和磷脂组分。经过薄层层析检识和傅里叶红外光谱分析,判断中性脂为甘油酯、游离脂肪酸等,糖脂为甘油糖脂和鞘糖脂等,磷脂为脑磷脂和卵磷脂等。最后利用体外细胞炎症反应模型判断上述脂质分离组分的抗炎活性。采用MTT法检测试样与RAW264.7细胞的兼容性,采用格里斯反应检测细胞培养基上清液中分泌型炎症介质一氧化氮(NO)的产量,采用酶联免疫法检测炎症因子肿瘤坏死因子-αα(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)等的释放量。试验结果显示,试样浓度高达50μg/mL时对细胞不产生显著毒性作用。同时能抑制脂多糖(LPS)刺激RAW264.7炎症介质NO的产量,并具有显著的剂量依赖效应,脂质表现出与炎症因子TNF-α,IL-1β和IL-6的分泌积极相关性且呈现明显的剂量效应关系。其中,糖脂和其他脂质相比具有极显著的抗炎活性。高剂量浓度下,其对NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的抑制率分别为(98.85±5.29)%、(91.74±1.42)%、(77.13±3.40)%、(93.82±1.07)%。从上述结果可以推测糖脂的抗炎活性与结构中脂肪酸、糖基、鞘氨醇等有关。2.三斑海马抗肿瘤活性成分的分离及体外生理活性评价本文研究三斑海马鞘糖脂和长链碱的抗肿瘤活性,糖脂经过皂化得到鞘糖脂,再经过酸水解得到长链碱粗品,经硅胶柱层析和大孔树脂HP-20脱除杂质,获得长链碱纯化组分。最后采用MTT法检测受试物抑制体外培养人肝癌细胞HepG2、人慢性髓原白血病细胞k562增殖的能力。结果显示,长链碱具有极显著抑制肿瘤细胞增殖的活性,其对HepG2细胞24h和48h的半数抑制浓度(IC5o)分别为8.87、6.42μg/mL,对K562细胞24h和48h的IC5o值分别为35.54、23.18μg/mL,抑制作用具有剂量和时间依赖的关系。与鞘糖脂相比,长链碱具有极显著的抗肿瘤活性,推测长链碱可能为鞘糖脂抗肿瘤作用的主要活性单元。3.三斑海马抗氧化活性成分的分离及活性评价本文研究三斑海马水提物的抗氧化活性。采用SephadexG-10凝胶过滤层析分离得到6个组分,对凝胶过滤层析分离组分的清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基能力和总还原力等抗氧化能力以及总氨基酸和总酚含量进行评价和测定。结果表明,分离获得的6个组分中的FrⅣ清除DPPH自由基活性最高,其IC5o值为0.25 mg/mL。FrⅣ的总还原力较高,羟基自由基清除活性及铁离子螯合能力最强,IC5o值分别为1.32mg/mL、27.41mg/mL。推测三斑海马小分子水溶性提取物的抗氧化活性与总酚、总氨基酸、小分子肽的含量和类型密切相关。