基于实时环介导等温扩增技术检测三种病原体的筛查体系研究

来源 :内蒙古医科大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:lianlianforever
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近年来,世界性食品安全问题一直是全球关注的热点问题。其中,作为分布最广泛、最常见疾病之一的细菌性食源性疾病的发病率也在不断上升。常见的食源性致病菌,如空肠弯曲杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌等,这些致病菌的感染与流行对人类健康造成了极大威胁。因此,急需一种可现场准确、快速检出这些致病菌的检测技术来控制各个病原体的感染及传播。常规病原体的检测技术,如PCR、ELISA、免疫胶体金技术等各具优势,但由于这些技术只限在实验室进行,且存在检测周期长、操作复杂等诸多不便因素,并不适用于现场检测。环介导等温扩增作为一种“简便、快速、高特异、高灵敏、低廉”的基因扩增新方法即可解决上述检测的诸多不便。因此本研究利用实时荧光LAMP检测法建立针对三种常见食源性致病菌:空肠弯曲杆菌、粪肠球菌及金黄色葡萄球菌的检测体系,最终通过在金属浴、小型离心机、小型涡旋器等便携式仪器内进行检测,实现对以上三种致病菌的现场快速检测体系的建立。实验中分别针对hipO、EF0027、Nuc基因建立空肠弯曲杆菌、粪肠球菌及金黄色葡萄球菌的LAMP检测体系,在对各检测体系优化的基础上进行特异性及灵敏度的检测,并与其他常用方法(PCR)进行比较。结果显示本研究建立的检测方法稳定性良好,总LAMP反应体系25μL,含有12.5μL 2×WarmStart LAMP Master Mix,0.5μL 50×fluorescence dye,2.5μL 10×LAMP Primer Mix,1μL基因组DNA,8.5μL ddH2O,65℃反应。三种待检菌的LAMP法检出特异性高,检出灵敏度均高于PCR法至少10倍,其中空肠弯曲杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌实时荧光LAMP检测法的最低检测限分别为34.2 fg/μL、98 fg/μL、1.08 fg/μL。将建立的三种病害检测方法与现场检测相结合,现场检测结果与实验优化结果一致,检测时间和准确度均符合要求。本研究建立的高灵敏度、高特异性的空肠弯曲杆菌、粪肠球菌和金黄色葡萄球菌LAMP检测技术,具有成本低廉、操作简单、检测时间短、结果易判读等诸多优势,为在现场对上述三种致病菌的快速检测提供技术支持,更适合用于现场、基层检疫及医疗机构的快速诊断。
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