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[研究背景及目的]随着肿瘤在全世界发病率的提高,人们对肿瘤的认识也逐渐加深。2011年,著名的Weinberg教授提出肿瘤具有十大特征,分别是：自给自足生长信号、抗生长信号的不敏感、抵抗细胞死亡、潜力无限的复制能力、持续的血管生成、组织浸润和转移、避免免疫摧毁、促进肿瘤的炎症、细胞能量异常和基因组不稳定与突变。利用这些特征,研究者们去寻找相应肿瘤的癌细胞,并靶向这群具有相应特征的细胞,有助于肿瘤的治疗。我国是肝病大国,因此肝癌发病率在我国居高不下。肝癌包括原发性肝癌和转移性肝癌,根据细胞分型可将原发性肝癌分为肝细胞型肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、胆管细胞型肝癌(cholangiocarcinoma, CC)及混合型肝癌(combined hepatocellular and cholangiocarcinoma, HCC-CC),大约75%的原发性肝癌属于HCC。肿瘤干细胞是肿瘤组织中具有很强增殖能力、表现部分干细胞特性的细胞亚群,对肿瘤放化疗抗性的产生和肿瘤的复发起关键作用。近年来,在肝癌组织中同样发现类似细胞,并称之肝癌干细胞(Liver Cancer stem cells, LCSCs)或肝癌前体细胞(Tumor Initiation Cells, TICs)。肝癌干细胞概念的提出,为深入认识肝癌发生发展机制及寻找肝癌诊治新方法、新策略提供了理论基础。然而,如何去识别并靶向这群肝癌干细胞,其细胞标志物成为近年来人们研究的热点。其中,Epcam、CD133和OV6是近年来被引用较多的肝癌标志物。但是,它们对肝癌干细胞的标记也并非完全特异,这就推动了人们对肝癌干细胞标志物的进一步研究和探索。LGR5 (leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5),全称为富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5,又名GPR49。它含有107个氨基酸,7次跨膜结构域,属于糖蛋白受体家族,是最新发现的Wnt信号通路的目标基因。研究证实LGR5是多种组织的干细胞标记物,并且和肿瘤的发生、发展密切相关。LGR5在多种瘤体组织中的过表达揭示了LGR5与肿瘤的发生、发展密切相关,尤其在大肠癌中,研究证实LGR5阳性的恶性肿瘤细胞代表了肿瘤干细胞,随之,LGR5作为大肠癌的肿瘤干细胞标志物得到广泛应用。然而,LGR5在肝脏及其肿瘤中的表达情况和具体功能还鲜为人知。基于此研究基础,我们提出LGR5在部分肝癌细胞中高表达,并通过Wnt信号通路调控此群细胞的成瘤能力,使其发挥肝癌干细胞的作用。[实验方法]1. 建立大鼠肝前体细胞活化模型,利用免疫组织化学方法检测大鼠肝脏前体细胞中LGR5的表达情况；选取肝癌样本组织,利用免疫组织芯片方法检测人肝癌组织中LGR5的表达；2.选取大鼠,建立DEN诱癌模型,利用RT-PCR和Western blot分别检测诱癌过程不同时间点LGR5蛋白和RNA表达水平；3. 利用流式细胞技术检测肝癌细胞表面LGR5比例；利用免疫磁珠分选技术将肝癌细胞系分选为LGR5阳性和阴性肝癌细胞群,比较两者功能学差异。4. 构建LGR5质粒并导入慢病毒载体,慢病毒感染肝癌细胞,构建LGR5稳定过表达细胞系；设计LGR5干扰序列,构建相应慢病毒载体并感染肝癌细胞,建立LGR5干扰细胞系；5. 利用免疫组织化学、组织免疫荧光等方法检测组织中LGR5与其他肝癌干细胞标志物的共定位情况；6. 利用Sphere成球实验检测LGR5的表达与成球能力的关系；利用RT-PCR检测LGR5的表达与干性基因表达的关系;7. 建立NOD/SCID鼠皮下荷瘤模型,检测细胞中LGR5表达的高低、LGR5阳性细胞与阴性细胞是否与体内成瘤能力强弱相关；8. 利用RT-PCR和Western blot分别检测LGR5与Wnt通路靶基因的关系、βcatenin蛋白水平变化；9. 利用Western blot和免疫共沉淀探讨LGR5与P-catenin降解复合体之间的关系。[实验结果]1.LGR5在大鼠肝前体细胞中高表达；在大鼠DEN诱癌过程中,相比对照LGR5明显高表达,提示LGR5促进肝癌的发生；2.18对人肝癌组织中LGR5在癌组织的表达高于癌旁组织,8对组织中癌旁高于癌；且LGR5在不同个体中的癌组织之间、癌旁组织之间高低表达不同,提示LGR5在人肝癌组织中的表达呈现差异性；3.相比LGR5阴性肝癌细胞,LGR5阳性肝癌细胞的干性相关基因呈高表达,体内成瘤能力增强,且在人肝癌组织中LGR5与OV6有良好的共定位关系,提示LGR5阳性的肝癌细胞具有肿瘤干细胞的特性；4. 相比对照肝癌细胞,过表达LGR5的肝癌细胞系呈现干性基因表达上调、成球能力及体内成瘤能力增强,提示在肝癌细胞中过表达LGR5可增强肝癌细胞的干细胞特性；5. 相比对照肝癌细胞,干扰LGR5肝癌细胞系呈现干性基因表达下调、成球能力及体内成瘤能力减弱,提示在肝癌细胞中干扰LGR5可减弱肝癌细胞的成瘤性；6.10种肝癌细胞系中LGR5与β-catenin表达呈现相关性,LGR5高表达的肝癌组织样本中β-catenin也呈现高表达(P<0.01),在过表达LGR5的肝癌细胞中,β-catenin降解速度减慢,Wnt下游靶基因表达上调,与β-catenin结合的GSK-3β减少,入核的β-catenin增多；在干扰LGR5细胞系中,β-catenin降解速度增加,Wnt下游靶基因表达下调,在GSK-3β抑制剂作用时β-catenin的增加明显弱于对照,反映P-catenin入核的荧光素酶活性明显减弱；提示LGR5通过增强Wnt/β-catenin信号通路活性促进肝癌发展；7.56对样本组织中,高表达LGR5组的无瘤生存率、总生存率均低于LGR5低表达组,提示LGR5与肝癌的不良预后相关。[实验结论]本研究从体内和体外分别证实了LGR5阳性肝癌细胞的干细胞特征,为将LGR5作为肝癌干细胞标志物提供了理论基础；进而,通过构建过表达和干扰LGR5的稳定细胞系,从细胞和动物水平分别阐明了LGR5的干性基因功能；接下来的实验说明LGR5通过调控Wnt/β-catenin通路增强肝癌细胞的成瘤性,从而调控肝癌的发展。