【摘 要】
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目的:端粒酶活化与肿瘤的发生发展和细胞的永生化有密切关系。端粒酶是一种逆转录酶,能以自身RNA为模板合成端粒的DNA重复序列(5-TTAGGG-3)n加在染色体末端,维持端粒长度,使
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目的:端粒酶活化与肿瘤的发生发展和细胞的永生化有密切关系。端粒酶是一种逆转录酶,能以自身RNA为模板合成端粒的DNA重复序列(5-TTAGGG-3)n加在染色体末端,维持端粒长度,使细胞发生永生化并致癌变。端粒酶主要组成包括:端粒酶RNA(hTR),端粒酶相关蛋白(TP1),端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase hTERT),现已有研究表明hTERT在80%-90%的肿瘤组织中阳性高表达,与端粒酶活性有高度相关性,是端粒酶活性的限速因子。因而本实验设计靶向封闭hTERTmRNA的反义硫代寡核苷酸(antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide, AS PS ODN),通过脂质体介导转染K562细胞,观察其对目的基因的抑制和对K562细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响,并对其作用机制进行初步探讨,为hTERT作为反义基因治疗靶点应用于白血病治疗提供一定的实验依据。方法:选用三种浓度的反义硫代寡核苷酸(AS PS ODN)分别为0.2μM、0.6μM、1.0μM,同时设空白组、脂质体组和三种相同浓度正义硫代寡核苷酸(S PS ODN)作为对照,分别转染到人红白血病细胞株K562,分别于24、48小时收集细胞进行检测。用RT-PCR检测靶基因hTERT mRNA的表达,PCR-ELISA检测细胞端粒酶活性、流式细胞仪检测细胞凋亡。观察AS ODN作用的特异性和不同浓度的AS ODN对K562端粒酶活性和细胞凋亡的影响。结果:1、K562细胞被转染24h后,对K562细胞hTERT基因表达的影响(用hTERT与β-actine的比值表示,数据为扫描比值)脂质体组(0.80±0.24)、0.2μM的AS ODN (0.69±0.12)和S ODN hTERT(0.72±0.25) mRNA的表达与空白对照组(0.85±0.28)无差异,0.6μM的AS ODN(0.42±0.16)比脂质体组能明显下调hTERT表达,而同
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