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目的肿瘤干细胞已经证实与肿瘤的发生、分化、复发、转移、化学治疗药物的抵抗有关。二甲双胍是最常见的降血糖药物,已经证实可通过不同的通路起到抗肿瘤的作用,但是二甲双胍抑制膀胱癌干细胞的作用还不清楚。我们希望通过对膀胱癌动物模型和细胞模型的研究,探究二甲双胍对膀胱癌干细胞增殖以及膀胱癌进展的影响。方法1.大鼠分为三组:对照组(经尿道灌注柠檬酸钠缓冲液+普通饮水)、MNU组(经尿道灌注MNU+普通饮水)、MET组(经尿道灌注MNU+1g/L二甲双胍作为饮水),每三周灌注2.5mg MNU一次,饮水每日更换。三组分别于第三周(30只)、第六周(26只)、第十二周(44只)处死相应分组的SD大鼠,测量他们的体重、血糖,留取膀胱组织,膀胱组织用10%的福尔马林固定24小时,然后进行石蜡包埋。石蜡组织块连续切片,随后进行常规HE染色;分别进行抗Ki-67抗体、抗Bcl-2抗体、抗CK20抗体、抗CK14抗体、抗OCT3/4抗体、抗COX2抗体、抗p-STAT3抗体免疫组化染色。2.采用MTT法研究20 mM二甲双胍对T24、RT4膀胱癌细胞增殖的影响;采用Western blot法研究0mM、1mM、5mM、10 mM、20 mM二甲双胍对T24、RT4膀胱癌细胞的Bcl-2、Cyclin D1、AMPK、p-AMPK蛋白的影响;流式细胞学研究0mM、1mM、5m M、10 mM、20 m M二甲双胍对T24膀胱癌细胞周期及凋亡的影响。3.采用ELISA法检测0mM、1m M、5mM、10mM、20mM二甲双胍对T24膀胱癌细胞生成PGE2的影响;采用Western blot法检测0m M、1m M、5mM、10 m M、20 mM二甲双胍、塞来昔布、外源性PGE2以及si COX2处理T24膀胱癌细胞后,对COX2、p-STAT3、STAT3、CK14、OCT3/4蛋白表达的影响。结果1.第三周膀胱组织HE染色对照组无异常,MNU组轻度非典型增生与MET组比较无统计学差异(MNU组10只大鼠vs MET组10只大鼠:24 vs 28,P=0.466),MNU组的中、重度非典型增生比MET组显著增多(MNU组10只大鼠vs MET组10只大鼠:36vs10,p=0.007)。第六周膀胱组织he染色,对照组未见异常,mnu组轻度非典型增生比met组少(mnu组8只大鼠vsmet组8只大鼠:15vs29,p=0.026),mnu组的中、重度非典型增生比met组显著增多(mnu组8只大鼠vsmet组8只大鼠30vs5,p=0.02),且mnu组有三处cis,而met组未发现cis。第十二周膀胱组织he染色,对照组未见异常,mnu组膀胱乳头状癌比met组少(mnu组14只大鼠vsmet组20只大鼠:19vs53,p=0.03),mnu组的膀胱浸润性癌比met组显著增多(mnu组14只大鼠vsmet组20只大鼠49vs46,p=0.034)。2.t24、rt4膀胱癌细胞给予20mm的二甲双胍处理、对照组不作特殊处理,分别处理5天,mtt检测细胞活性,处理组较未处理组细胞活性下降、生长缓慢,且在处理24小时后开始出现抑制细胞生长的效应。一磷酸腺苷蛋白激活酶(ampk)已经确认是二甲双胍的分子靶点,t24细胞不同浓度的二甲双胍处理后westernblot分析其p-ampk蛋白表达增加而总的ampk蛋白无明显变化,t24、rt4细胞bcl-2、cyclind1蛋白表达降低且表现出剂量依赖性。t24膀胱癌细胞不加血清饥饿24小时后分别给予0mm、1mm、5mm、10mm、20mm二甲双胍处理24小时,进行周期和凋亡分析,二甲双胍处理组g1/s期细胞数增加,而且凋亡细胞的数量增多。对第三周、第六周、第十二周大鼠膀胱组织进行抗ki-67抗体、抗bcl-2抗体的免疫组化染色结果,二甲双胍处理组不仅染色强度较未处理组弱而且染色细胞数也较少。3.为了研究二甲双胍是否对不同的祖细胞可以发挥不同的效应,我们研究了两种干细胞标志物即ck14和oct3/4。我们对第三周、第六周、第十二周大鼠膀胱组织进行抗ck14抗体、抗oct3/4抗体的免疫组化染色结果,二甲双胍处理组染色强度较未处理组弱,染色阳性细胞数也较未处理组少,同时ck20染色强度增加和阳性的细胞数增加。这就表明二甲双胍可以选择性抑制浸润性病变而对乳头状病变无影响。这些数据说明二甲双胍可抑制基底细胞的增殖从而抑制早期原位癌、浸润性肿瘤的进展。4.为了探讨研究二甲双胍抑制ck14、oct3/4阳性细胞增殖的机制,我们研究二甲双胍在pge2合成酶cox2中的作用。对第三周、第六周、第十二周大鼠膀胱组织进行抗cox2抗体的免疫组化染色结果,在每个时间点,二甲双胍处理组染色强度都较未处理组弱,染色阳性细胞数也较未处理组少。t24膀胱癌细胞给予0mm、1mm、5mm、10mm、20mm二甲双胍处理24小时后进行westernblot分析cox2蛋白,结果表明二甲双胍剂量性依赖地抑制cox2的表达,与动物实验的结果相一致。pge2作为cox2的催化产物,elisa结果也证实了:二甲双胍确实可以抑制pge2的合成。有研究表明,在直肠癌中pge2可以调控jak/stat3信号通路;同时也有研究证实膀胱癌中STAT3不仅可以调控CK14阳性干细胞的增殖,也可以导致浸润性膀胱癌的进展。因而我们推测二甲双胍抑制膀胱癌的进展是通过COX2/PGE2/STAT3这一通路。体内原位膀胱癌SD大鼠模型中,P-STAT3的免疫组化结果证实了二甲双胍抑制STAT3的活化。同样,体外细胞实验,二甲双胍剂量依赖性地抑制了p-STAT3蛋白而总STAT3蛋白无变化,与此同时,也下调了CK14和OCT3/4这两个干性指标。这些结果暗示了:二甲双胍通过COX2/STAT3通路抑制膀胱癌的进展。为证实这一通路,我们用COX2特异性的抑制剂塞来昔布(或二甲双胍)来处理T24细胞,Western blot结果证实塞来昔布特异性地抑制COX2后,相应的P-STAT3、CK14和OCT3/4等下游蛋白水平也被下调与二甲双胍的效应一致。进一步我们用si RNA技术敲低COX2,si COX2-1、siCOX 2-3能敲低COX2从而抑制p-STAT3、CK14、OCT3/4蛋白的表达,总的STAT3蛋白未见改变,其中siCOX 2-2未敲低COX2的原因不太清楚。为研究PGE2在这个通路中的影响,我们给予外源性的PGE2处理T24膀胱癌细胞,Western blot结构表明p-STAT3、CK14、OCT3/4蛋白的表达升高,因此,这些结果表明二甲双胍能通过下调COX2,从而抑制COX2/PGE2/STAT3信号通路来实现抑制膀胱癌CK14+干细胞的增殖。结论1.二甲双胍虽然不能抑制原位膀胱癌模型膀胱肿瘤的形成,但能减缓浸润性膀胱癌形成的时间以及减少浸润性病变的数量;2.二甲双胍可以抑制膀胱癌干细胞的增殖、促进膀胱癌干细胞的凋亡;3.二甲双胍可下调COX2和PGE2达到抑制STAT3的磷酸化和活化。综上所诉二甲双胍通过COX2/PGE2/STAT3抑制膀胱癌干细胞的增殖以及膀胱癌的进展